胃癌组织中H

　　作者：顾华丽，董静 (青岛大学医学院附属医院急诊内科，山东 青岛 266003 )

　　[摘要] 目的 探讨人胃癌组织中Hras、Kras基因第12密码子点突变情况及意义。方法 收集43例胃癌及相应癌旁组织标本。应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析法检测Hras、Kras基因第12密码子点突变情况。结果 43例胃癌组织中有1例发生Hras突变(1/43，2.3%)，癌旁组织中未发生突变。Kras在胃癌及癌旁组织中均未发生突变。结论 胃癌组织中Hras、Kras基因第12密码子点突变率低，在胃癌的发生中不起主要作用。

　　[关键词] 胃肿瘤; ras基因;聚合酶链反应

　　DETECTION OF POINT MUTATION OF CODON 12 OF Hras AND Kras IN GASTRIC CANCER TISSUESGU HUALI, DONG JING (Department of Emergency, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the point mutation of codon 12 of Hras and Kras in tissues of gastric carcinoma. MethodsFortythree gastric cancer specimens and paraneoplastic tissues were obtained. Point mutation in codon 12 of Hras and Kras were detected by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP). ResultsOne case (1/43, 2.3%) of mutation of Hras 12 codon was detected, no mutation was found in paraneoplastic. No mutation of Kras was detected in both cancer and paraneoplastic tissues. ConclusionThe point mutation rate of codon 12 of Hras and Kras is low in gastric cancer, which suggestive of little role in the genesis of the cancer.

　　[KEY WORDS]stomach neoplasms; gene, ras; polymerase chain reaction

　　研究表明，约30%的人类肿瘤有ras基因突变，并有Ras蛋白高表达[1]，突变的Ras蛋白可刺激细胞增殖和抑制凋亡从而促使肿瘤发生、发展。本研究通过检测人胃癌和癌旁组织中Hras、Kras基因第12密码子点突变情况，来探讨其在胃癌发生、发展中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源及临床病理特点

　　43例胃癌和癌旁组织标本均取自青岛大学医学院附属医院2000年6月～2001年6月行胃大部切除并经病理证实为胃癌的病人。均于术中取新鲜胃癌组织和相应癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)，放入经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理且高压灭菌的15 mL离心管中，-70 ℃冻存备用。

　　43例病人中，男35例，女8例;年龄31～81岁，平均 (56.9±14.0)岁。病变部位：胃窦部25例，胃体部15例，胃底及贲门部1例，残胃和幽门管部各1例。病理分型：腺癌41例，印戒细胞癌2例。组织学分级：高分化1例，中分化9例，低分化33例。临床分期均为进展期。淋巴结转移31例，无淋巴结转移12例。

　　1.2 主要仪器设备和试剂

　　PCR扩增仪480型(美国PE公司);恒压恒流电泳仪、微型水平电泳槽(BioRad公司);高速低温台式离心机3K30型(德国Hereaus公司);紫外线透射仪(美国PE公司);影像分析系统(北京亚力恩凝胶分析系统2000); DHanks液(美国GIBCO公司);蛋白酶K(德国Merck公司);PCR反应体系，饱和酚，氯仿，异戊醇，Tris，EDTA，硼酸和琼脂糖等(上海生工生物技术服务有限公司)。

　　1.3 聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析

　　1.3.1 Hras基因 依据制造商说明提取胃癌及癌旁组织的DNA，每例取DNA模板 1 μL 进行Hras基因第12密码子PCR扩增，引物参照文献[2]设计，引物序列(170 bp)：5′CAGGGCCCTCCTTGGCAGG3′(正义)，5′GTCGTATTCGTCCACAAAATGG3′(反义)。94 ℃预变性5 min， 然后 1期顾华丽，董静胃癌组织中Hras及Kras基因第12密码子点突变的检测及意义5794 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 扩增35个循环，最后72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，与PCR Marker对照，紫外线透射仪出现170 bp条带表明扩增成功。扩增产物用限制性内切酶HpaⅡ酶切，酶切产物于80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，对照PCR Marker判断扩增产物是否被切开，野生型可观察到66、56、48 bp三条电泳带，突变型只能观察到122、48 bp两条电泳带。

　　1.3.2 Kras基因 试剂购于华美公司。引物序列(162 bp)：5′ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3′(正义)，5′CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCACCAGTA3′(反义)。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共扩增35个循环，最后72 ℃延伸6 min。取PCR扩增产物5 μL溶解于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，与PCR Marker对照，紫外线透射仪下出现162 bp条带表明扩增成功。扩增产物用限制性内切酶BstNⅠ酶切过夜，酶切产物于80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，对照PCR Marker判断扩增产物是否被切开，野生型可观察到133、29 bp两条电泳带，突变型只能观察到162 bp一条电泳带。

　　2 结 果

　　43对标本Hras基因第12密码子PCR扩增均成功，43例胃癌组织中有1例发生突变(2.3%)，癌旁组织中未发生突变。见图1。Kras在胃癌及癌旁组织中均未发生突变。

　　图1 Hras基因第12密码子酶切产物电泳图

　　3 讨 论

　　哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是Hras、Kras和Nras，其基因突变的最常见的方式就是点突变，多发生在N端第12、13和61密码子，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为GGT突变成GTT。业已证明，ras基因单点突变足以引发恶性转化。ras基因突变率在不同人类肿瘤有明显不同，国外文献报道，最高为胰外分泌腺癌，达90%，结肠癌为40%～50%，肺癌和膀胱癌为40%[1，3]，而胃癌较低在10%以下。但后者各家报道并不一致，日本学者报道胃癌主要是Kras基因点突变，KIHANA等[4]发现43%的胃腺瘤、9%的胃腺癌有Kras基因点突变，无Hras突变;韩国人群中亦无Hras突变;对欧洲胃癌高发区人群研究未发现ras突变[5,6];国内邓国仁等[7]报道我国胃癌主要为Hras基因点突变，达41%。此后国内多次文献报道胃癌中Hras基因点突变率为13.6%～33.3%，Kras基因点突变率为0～4.8%，与邓国仁等的结果相似，并推测Hras基因第12密码子点突变是中国人胃癌的特点之一[8,9]。因此，本实验对43例病人胃癌及癌旁组织Hras、Kras基因第12位密码子点突变进行研究，结果显示，43对标本PCR扩增均成功，43例胃癌组织中有1例发生Hras基因第12位密码子突变(2.3%)，癌旁组织中未发生突变，而Kras在胃癌及癌旁组织中均未发生突变。此结果与国内相关报道并不一致，原因可能为： ①胃癌发生发展受诸如饮食、地理环境、种族差异等多因素的影响，文献报道也证实某些胃癌相关基因(如ras)在不同地域、种族的表达确有差异， 所以虽同为中国人，因所处地域不同，饮食习惯差异，ras基因第12位密码子点突变率可以有很大差异。 ②研究手段的影响。对ras基因点突变的检测方法目前常用的有三种，一是PCRDNA测序，此为金标准，但操作复杂; 二是PCRRFLP， 三是PCR单链构象多肽性分析法(SSCP)， 据文献报道后两种方法有假阴性结果的出现[9]。 若几种方法联合应用可增加结果的可靠性。综上所述，胃癌组织中Hras、Kras基因第12密码子点突变率低，在胃癌的发生中不起主要作用。因本实验只检测了Hras、Kras基因的第12密码子点突变情况，可能存在这两个基因其他位点或Nras基因不同位点的突变，有待于进一步研究。

　　[参考文献]

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