胆汁致胃黏膜损伤中瘦素、环氧合酶-2及p27的表达

作者：宋银雪，龚均    作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院消化科，陕西西安 710004

【摘要】  　　目的 通过大鼠实验模型观察瘦素(leptin)、环氧合酶-2(COX-2)及p27在胆汁所致胃黏膜损伤中的作用。方法 SD大鼠分成4组：十二指肠胃反流(duodenogastric reflux, DGR)组、DGR+胆管结扎(bile duct ligation, BDL)组、胆管结扎组(BDL)、假手术组(control, C)组。术后12周处死大鼠，观察胃黏膜损害及病理组织学改变，计算DIXON积分；免疫组化(SP)法检测各组大鼠胃黏膜瘦素、COX-2及p27表达。结果 DIXON积分DGR组、DGR+BDL组较BDL组及假手术组积分均升高(P<0.05)，DGR组较DGR+BDL组DIXON积分升高(P<0.05)；DGR组、DGR+BDL组与BDL组及假手术组比较大鼠胃黏膜瘦素、COX-2高表达(P<0.05)，p27低表达(P<0.05)，DGR组比DGR+BDL组高表达尤为明显(P<0.05)。DIXON积分与瘦素、COX-2表达呈正相关，与p27表达呈负相关。结论 胆汁反流致胃黏膜损伤过程中，瘦素、COX-2及p27蛋白与病变的修复过程有关。

【关键词】  胆汁 胃黏膜 瘦素 COX-2 p27

　　Expressions of leptin, COX-2 and p27 in bile-induced gastric mucosa injury

　　Song Yinxue, Gong Jun

　　(Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To explore the role of leptin, COX-2 and p27 in bile-induced gastric mucosal injury in rats. Methods  SD rats were divided into 4 groups: DGR (duodenogastric reflux) group, DGR+BDL (ligation of bile duct) group, BDL group and control group. The pathological changes of gastric mucosa and tight junction were observed, DIXON scores were warked out after 3 months. Immunohistochemistry was used to detect the expression of leptin, COX-2 and p27 in gastric mucosa with different lesions. Results  The DIXON scores in DGR and DGR+BDL group were higher than those in BDL group and control group (P<0.05). In addition, DIXON scores were higher in DGR group than in DGR+BDL group (P<0.05). The expressions of leptin and COX-2 increased in DGR group and DGR+BDL group than in BDL group and control group (P<0.05), while p27 decreasd (P<0.05). DGR group was more notable than DGR+BDL group (P<0.05). The expression of leptin and COX-2 was positively correlated with DIXON integral, but negatively related to p27. Conclusion  Leptin, COX-2 and p27 are all concerned with renovating pathological changes in bile-induced gastric mucosal injury in rats.

　　KEY WORDS: bile; gastric mucosal; leptin; COX-2; p27

　　近年研究发现反流至胃内的胆汁、胰液和肠液等十二指肠内容物可造成胃黏膜细胞损伤［1］。瘦素、COX-2和p27这三种因子均可通过调节细胞周期来调节胃黏膜细胞增殖及凋亡。瘦素在细胞内能与许多信号分子相互作用，激活JAK/STAT、MAPK、磷酸肌醇和脂类代谢等信号通路，参与多种生理功能的调控，维护黏膜上皮完整并促进其增生［2］；COX-2的表达增加了PGE2的合成，诱导细胞增殖并刺激bcl-2蛋白的表达，通过促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，使细胞增殖与凋亡失去平衡［3］；p27蛋白可以启动、诱导凋亡，并通过抑制cyclin-CDK复合物的活性来抑制CDKs的活性，从而负性调节细胞周期，抑制细胞增殖［4］。本研究通过SD大鼠十二指肠胃反流模型和结扎胆管后的十二指肠胃反流模型，比较观察了胆汁致胃黏膜损伤后瘦素(leptin)、环氧合酶-2(COX-2)及p27的表达，并观察三者之间的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　健康成年SD大鼠40只，雌雄各半，体重180-200 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。吻合口缝合采用医用6/0的可吸收缝合线。免疫组化的主要试剂leptin兔多克隆抗体的浓缩液(bs-0108R)购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠单抗p27(SC-1641)、COX-2羊多抗IgG(SC-1746)及SP试剂盒(SP-9003、SP-9002)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2  动物的分组及制模

　　SD大鼠随机分为4组。胃十二指肠返流(duodenogastric reflux, DGR)组(10只)：参考董西林［5］手术方法制作十二指肠胃反流模型(将距Treitz韧带以下4cm处的空肠侧壁与胃大弯前胃部分的前壁，按顺蠕动方向进行侧侧吻合,再将十二指肠Treitz韧带以下结扎；胆管结扎(bile duct ligation, BDL)组(10只)：参考张茹［6］手术方法单纯结扎胆管(选胆总管近左右肝管汇合端作结扎,保留胰管通畅，胰液继续排入十二指肠)；DGR+BDL组(10只)：步骤同上述DGR+BDL模型；C组：假手术组(正常对照组，10只)：上腹正中切口进入腹腔，仅翻动胃及肠管，然后关腹。大鼠手术后12周,留取血清、胃液，采用西安派斯公司生产的XDJ-IA型pH监测仪测定胃液pH值，用酶法检测血清总胆汁酸(TBA)。

　　1.3  HE染色观察SD大鼠胃黏膜的病理组织学变化

　　在吻合口附近(包括腺胃部分的胃窦、胃体)黏膜组织4-6块，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察病理组织学改变。病理形态学积分标准：依据DIXON反流性胃炎组织学积分标准［7］，按以下胃黏膜病变的轻重程度进行计分：小凹延长，腺颈细胞增生(0-3分)；黏膜浅层血管扩张充血(0-3分)；固有膜内平滑肌纤维增生(0-3分),平滑肌细胞隆起或黏膜层变薄，分别将稍有隆起、隆起占黏膜层1/2或全层隆起记为1-3分，无则记为0分，间质水肿(0-3分)，慢性或中性粒细胞浸润轻到重(0-3分)，记录每个病例的积分。

　　1.4  免疫组化法检测瘦素、COX-2及p27表达

　　所有标本经40 mL/L中性甲醛溶液固定制作石蜡切片，载玻片均经多聚赖氨酸防脱片处理，采用SP三步法作免疫组化染色。具体方法按试剂盒说明进行。瘦素、COX-2及p27一抗工作浓度为1∶200，采用高压抗原修复。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替第一抗体作为空白对照。

　　染色结果判断：瘦素阳性表达为细胞质内棕黄色颗粒。COX-2阳性表达位于细胞核膜及内质网，且在核膜的表达较内质网为强，还可见于核内、细胞胞质或核膜上，呈棕黄色颗粒，p27蛋白阳性表达定位于细胞核。根据染色强度和阳性细胞百分比［5］，分别记为-、+、、4个等级。无阳性细胞数为阴性(-)，阳性细胞数<25%且染色浅黄为(+)，阳性细胞数25%-50%染色呈黄色为()，阳性细胞数>50%且染色棕黄色为()。光镜下(×100)选取染色清晰的连续5个视野，再在高倍镜(×200)下观察。应用Image-pro plus6.0图像分析软件进行分析，计算每视野阳性染色的积分光密度值(integrated optical density, IOD)表示相对表达量。

　　1.5  统计学处理

　　所有数据采用SPSS 15.0软件进行分析。计量资料以均数士标准差表示，采用单因素多组资料的方差分析(One-Way ANOVA)，进行F检验(方差不齐时采用F′检验)，两两比较采用LSD法，P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01认为有非常显著性差异。相关性采用Pearson相关分析，计算相关系数(R)进行相关性分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  各组大鼠胃液pH及血清总胆汁酸测定

　　见表1。表1  各组大鼠胃液pH及血清总胆汁酸测定（略）

　　2.2  HE染色结果

　　DGR组大鼠胃黏膜可见淋巴细胞、浆细胞浸润，部分有成堆淋巴细胞聚集灶，少数可见有中性粒细胞浸润。腺胃腺体底部呈囊状扩张，黏膜肌层增厚，向黏膜固有层伸展呈分支状插入腺体之间。胃窦黏膜胃小凹增生,黏膜固有层充血水肿，没有肠上皮化生及胃黏膜萎缩等，基本符合反流性胃炎的表现。DGR+BDL组改变较轻，慢性炎细胞浸润较少并局限于黏膜层1/3，部分黏膜充血。而BDL组、假手术组病理组织学没有明显异常改变。DIXON积分DGR组、DGR+BDL组与BDL组高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，而且DGR 组高于DGR+BDL组积分，有统计学意义(P<0.05)，BDL组与假手术组比较差异没有统计学意义(P>0.05，表2)。

　　2.3  瘦素、COX-2、p27在胃黏膜组织中的表达

　　瘦素阳性表达BDL组及假手术组多集中在胃黏膜的中下2/3，DGR组与DGR+BDL组表达增加，超过胃黏膜的中下部分，部分在胃黏膜的表面表达；COX-2在BDL组及假手术组的胃黏膜组织中几乎不表达；p27蛋白阳性表达在BDL组及假手术组多集中在胃黏膜的非增生性表层上皮细胞中，只在黏膜上皮表层2/3，而在胃黏膜腺颈部的增生细胞中表达则罕见。DGR组与DGR+BDL组较BDL组及假手术组p27蛋白表达水平降低，DGR组较DGR+BDL组表达降低更明显。    　　瘦素积分光密度DGR组与DGR+BDL组、BDL组及假手术组比较均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；DGR+BDL组与BDL组及假手术组比较升高，但没有统计学意义(P>0.05)；BDL组与假手术组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。COX-2积分光密度DGR组、DGR+BDL组高于BDL组及假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；DGR组高于DGR+BDL组，差异有统计学意义(P<0.05)；BDL组与假手术组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。p27积分光密度DGR组与DGR+BDL组、BDL组及假手术组比较均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；DGR+BDL组与BDL组及假手术组比较降低，但没有统计学意义(P>0.05)；BDL组与假手术组比较没有统计学意义(P>0.05)(表2，图1-图3)。表2  各组大鼠反流性胃炎组织学DIXON积分和免疫组化瘦素、COX-2、p27染色积分光密度（略）

　　2.4  相关回归分析

　　DIXON积分与瘦素积分光密度显著正相关(r=0.558，P<0.05)；DIXON积分与COX-2积分光密度有显著正相关(r=0.808，P<0.05)；DIXON积分与p27积分光密度显著负相关(r=-0.487，P<0.05)；p27积分光密度与COX-2积分光密度(r=-0.436，P<0.05)显著负相关；瘦素积分光密度与p27积分光密度(r=-0.521，P<0.05）有显著负相关；瘦素积分光密度与COX-2积分光密度(r=0.381，P<0.05)显著正相关。

　　3  讨论

　　瘦素是近年来研究较多的多肽类激素之一，研究报道胃黏膜是瘦素的来源地，且多集中在胃黏膜的主细胞、壁细胞和胃腺基底侧的内分泌细胞［8］，瘦素对胃黏膜具有保护作用，胃黏膜细胞的瘦素蛋白可以诱导胃黏膜细胞增殖，从而有助于保护胃黏膜的完整性。动物实验表明瘦素的分泌量与溃疡损伤严重程度有正相关性，提示瘦素可促进胃溃疡愈合［9］，瘦素具有拟促上皮生长因子的作用，同时可增加黏膜血流量、促进毛细血管形成［10］，还可以通过JAK-STAT途径调节炎症反应，刺激T淋巴细胞增殖和分化［2］。本实验用大鼠十二指肠胃反流模型(DGR组，十二指肠内容物如胆汁、胰液和肠液全部反流至胃内)和结扎胆管后的十二指肠胃反流模型(DGR+BDL组，去除胆汁的十二指肠内容物反流至胃内)，比较观察了胆汁致胃黏膜损伤后瘦素(leptin)、环氧合酶-2(COX-2)及p27的表达变化。在术后12周采用pH监测仪测定胃液pH值测定DGR组、DGR+BDL组大鼠胃液显著高于假手术对照组，提示碱性的十二指肠液胆汁、胰液、肠液等反流至胃内，中和胃酸，证明大鼠模型是成功的。另外，检测血液总胆汁酸，DGR+BDL组、BDL组显著高于DGR组、假手术组，提示胆管结扎去除了十二指肠液反流液中的胆汁；而胃液总胆汁酸则DGR组显著高于其他组，提示胆汁、胰液等十二指肠液反流人胃内，使胃液胆汁酸明显升高，再次证明了该模型的可靠性。本实验发现DGR组大鼠胃黏膜损害较DGR+BDL组重，胃底黏膜出现更严重，充血和小凹超常增生，其损伤积分以DGR组最严重。假手术组胃黏膜就有瘦素表达，且多集中在胃黏膜的中下2/3，与文献相同［8］。而DGR、DGR+BDL瘦素表达较假手术组升高，提示胃黏膜损伤大鼠瘦素表达显著升高，且表达在胃黏膜的中上2/3，DGR较DGR+BDL瘦素表达高，各组DIXON积分与瘦素积分光密度呈正相关(P<0.05)，说明胆汁反流致胃黏膜损伤过程中瘦素对胃黏膜具有保护作用，并作为一种促进胃黏膜增殖的因子参与病变的修复过程。

　COX-2是迅速应答基因，在正常胃黏膜表达很少或几乎检测不到，而在炎症部位表达明显增加，一旦发生黏膜损伤，它会发生快速上调，并且在损伤修复过程中发挥重要作用。许多研究表明，COX-2有保护胃黏膜的作用，Gudis等［11］发现COX-2能够产生多种生长因子，包括肝细胞生长因子(HCF)、血管内皮生长因子(VEGF)及其他增殖因子促进上皮细胞的增殖、游走和血管新生等，参与胃黏膜的防御和修复。COX-2的另一个重要作用是加速溃疡愈合， Schmassmann［12］给大鼠注射选择性COX-2抑制剂后可延迟溃疡愈合，提示COX-2有利于保护胃黏膜。本研究结果显示，在假手术组及BDL组胃黏膜中COX-2几乎不表达，胃黏膜损伤时大鼠COX-2表达增高，COX-2表达随黏膜损伤严重程度而增加，DGR较DGR+BDL表达增加，DIXON积分与COX-2积分光密度成正相关(P<0.05)，这些均表明COX-2在胆汁反流致胃黏膜损伤过程中对胃黏膜同样具有保护作用并参与病变的修复过程。

　　在动物实验中发现p27kip1在绝大多数哺乳动物的各种正常组织中均有表达［4］，在正常胃黏膜，p27蛋白主要表达于非增生性表层上皮细胞中，而在胃黏膜腺颈部的增生细胞中表达则罕见，p27蛋白的作用是参与细胞周期调控，抑制增殖和诱导凋亡。体内外研究均表明，慢性HP 感染时，胃上皮细胞细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors, CDKI)p27表达减少，作为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases, CKIs)成员，p27有抗炎症损伤作用，而且有增加胃腺体增殖、细胞分化的作用［13］。本实验假手术组、BDL组大鼠胃黏膜p27蛋白只在黏膜上皮表层2/3表达，与文献［4］相同；DGR、DGR + BDL组大鼠胃黏膜p27蛋白表达水平降低，提示胃黏膜损伤时大鼠p27蛋白表达降低，可能也是促进组织修复的保护性反应。DGR组与DGR + BDL组比较降低，差异有统计学意义(P<0.05)，DIXON积分与p27积分光密度呈负相关(P<0.05)，这说明黏膜病理损伤程度不同，则p27蛋白表达亦有不同，胆汁反流致胃黏膜损伤过程中p27蛋白参与细胞周期调控，参与病变修复过程。

【参考文献】  　　［1］Mabrut JY, Collard JM, Baulieux J. Duodenogastric and gastroesophageal bile reflux ［J］. J Chir, 2006, 143(6):355-365.

　　［2］Schneider R, Bornstein SR, Chrousos GP, et al. Leptin mediates a proliferative response in human gastric mucosa cells with functional receptor ［J］. Horm Metab Res, 2001, 33(1):1-6.

　　［3］Oba M, Miwa K, Fujimura T, et al. Chemoprevention of glandular stomach carcinogenesis through duodenogastric reflux in rats by a COX-2 inhibitor ［J］. Int J Cancer, 2008, 123(7):1491-1498.

　　［4］Chu I, Sun J, Arnaout A, et al. p27 Phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2 ［J］. Cell, 2007, 128 (2):281-294.

　　［5］董西林，董蕾，宁利，等. 十二指肠胃反流模型大鼠胃黏膜组织CyclinD1、p16蛋白表达［J］. 医学临床研究, 2004, 21(5):467-475.

　　［6］张茹，龚均，史冉庚，等. 胆汁反流对大鼠食管黏膜炎症损伤和凋亡的作用 ［J］. 四川大学学报(医学版), 2006, 37(5):750-753.

　　［7］Dixon MF, Neville PM, Mapstone NP, et al. Bile reflux gastritis and Barrett's oesophagus: further evidence of a role for duodenogastro-oesophageal reflux ［J］? Gut, 2001, 49(3):359-363.

　　［8］Cammisotto PG, Gingras D, Renaud C, et al. Secretion of soluble leptin receptors by exocrine and endocrine cells of the gastric mucosa ［J］. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol, 2006, 290(2):G242-G249.

　　［9］Konturek PC, Brzozowski T, Sulekova Z, et al. Role of leptin in ulcer healing ［J］. Eur J Pharmacol, 2001, 414(11):87-97.

　　［10］Erkasap N, Uzuner K, Serteser M, et al. Gastroprotective effect of leptin on gastric mucosal injury induced by ischemia-reperfusion is related to gastric histamine content in rats ［J］. Peptides, 2003, 24(8):1181-1187.

　　［11］Gudis K, Sakamoto C. The role of cyclooxygenase-2 in gastric mucosal protection ［J］. Dig Dis Sci, 2005, 50(1):S16-S23.

　　［12］Schmassmann A, Zoidl G, Peskar BM, et al. Role of the different isoforms of cyclooxygenase and nitric oxide synthase during gastric ulcer healing in cyclooxygenase-1 and-2 knockout mice ［J］. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol, 2006, 290(4):G747-756.

　　［13］Sung SK, Patricia M, Tamako AK, et al. Altered expression of Skp2,c-Myc and p27 proteins but not mRNA after H.pylori eradication in chronic gastritis ［J］. Modern Pathol, 2006, 19(1):49-58.