食管癌中uPA、uPAR蛋白表达及其临床意义

    作者：祝淑钗，王亚飞，沈文斌，李娟，苏景伟，王玉祥    作者单位：石家庄，河北医科大学第四医院放疗科     【摘要】  目的 探讨食管癌中uPA、uPAR蛋白表达与临床病理因素间的关系及其对单纯放疗预后的影响。方法 应用免疫组化SP法检测59例食管癌和41例食管癌旁组织中uPA、uPAR蛋白表达情况，分析蛋白表达与临床病理因素间的关系及其对食管癌放疗预后的影响。结果 59例食管癌组织中uPA、uPAR蛋白阳性表达率分别为76.27%、77.97%，41例食管癌旁组织中阳性表达率分别为48.78%、43.90%，癌组织和癌旁组织中两种蛋白的阳性表达率比较差异均有统计学意义（P<0.01）。胸部CT扫描显示食管病变层面椎前三角形间隙消失者uPA蛋白强阳性表达率为70.37%，明显高于三角形间隙存在者的43.75%,两者比较差异有统计学意义（P=0.040）。发生远处转移者uPA蛋白阳性表达率比无远处转移者也显著升高，分别为100%和68.89%，两者比较差异有统计学意义（P=0.042）。进一步分析发现uPA、uPAR蛋白表达与食管癌预后未见明显相关性，而uPA、uPAR两种蛋白的表达呈显著性正相关。结论 食管癌中uPA蛋白高表达可能与肿瘤局部浸润及远处转移的发生有关。

    【关键词】  食管鳞癌；uPA； uPAR；免疫组化；放射治疗

    Study of uPA and uPAR Protein Expression and Prognostic Factors in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Treated by Radiotherapy

    ZHU Shuchai,WANG Yafei,SHEN Wenbin,LI Juan,SU Jingwei,WANG Yuxiang

    Department of Radiation Oncology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,ChinaAbstract：Objective   To explore the relationship between the uPA,uPAR protein expression and  the prognostic  with clinical and pathologic factors in esophageal squamous cell carcinoma treated by radiotherapy.Methods  We measured uPA,uPAR protein expression in 59 specimens of esophageal carcinoma and 41 pericarcinoma tissues with immunohistochemistry,and analyzed the relationship between these protein expression and the clinicopathological parameters,and explored the prognostic factors in esophageal squamous cell carcinoma treated by radiotherapy alone.Results  The positive rates of  expression of uPA in specimens of esophageal carcinoma and the pericarcinoma tissues were 76.27% and 48.78% respectively,and the difference had statistical significance (P<0.01).The rates of positive expression of uPAR in specimens of esophageal carcinoma and the pericarcinoma tissues were 77.97% and 43.90% respectively,and the difference had statistical significance (P<0.01).The expression of uPA was significantly correlated with the status of fat interspace between the esophageal lesion and vertebrae in the CT scanning.The rates of strong positive expression was 43.75% in which the fat interspace existed,while it was 70.37% with the fat interspace elapsed,and there were statistical significance (P=0.040).The rates of positive expression was 100% with distant metastasis patients,while it was 68.89% in those without distant metastasis,this difference had statistical significance (P=0.042).The protein expression of uPA and uPAR did not significantly effect on prognosis and the shortterm result of esophageal carcinoma.Conclusion  Maybe the protein expression of uPA,uPAR were correlated with the local  invasion and distant metastasis of the esophageal squamous cell carcinoma.

    Key words：Esophageal squamous cell carcinoma； uPA； uPAR；Immunohistochemistry；Radiotherapy

    为探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、uPA 受体（uPAR）蛋白表达在食管癌发生、发展、浸润和转移中的作用，本研究采用免疫组化SP法检测59例食管镜咬检鳞癌组织及其41例癌旁组织标本中uPA、uPAR蛋白的表达情况，分析uPA、uPAR蛋白表达与食管癌临床病理因素、放疗后近期疗效及预后的关系，为食管癌的治疗及预后判断提供新的指标。

    1  资料与方法

    1.1  病例选择

    收集我院放疗科2002年2月～2004年8月间初治的食管癌患者，疗前行常规胸部CT扫描、腹部超声或CT扫描、常规血生化和外周血象检查。全部病例均于放疗前胃镜室取材癌组织及癌旁组织（肉眼观察为正常粘膜但Lugol’s液染色为不染区），癌组织均经病理证实为鳞状细胞癌，癌旁组织为不典型增生。男36例，女23例，年龄37～82岁，平均63岁，所有患者均接受单纯根治性放射治疗。采用我科[1]提出的分期标准进行临床分期，T1～2期48例，T3～4期11例,N0 29例， N1 13例（均为纵隔淋巴结转移），N2期17例（纵隔和锁上淋巴结转移13例，仅锁上淋巴结转移4例）,临床TNM分期Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ期28例。

    1．2  标本检测方法

    标本经10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μｍ切片，进行免疫组织化学染色。主要试剂为兔抗人多克隆抗体uPA(博士德生物工程有限公司)；兔抗人多克隆抗体uPAR(博士德生物工程有限公司)； 生物素化通用二抗工作液（北京中杉生物技术公司）；辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液（北京中杉生物技术公司）；DAB显色剂（北京中杉生物技术公司）。以PBS代替一抗作为空白对照,以已知的uPA、uPAR阳性染色切片作为阳性对照。

    1．3  放射治疗方法

    先行热塑体膜固定体位，标记三维激光灯参考点以保证治疗重复性。CT扫描模拟定位后，应用美国Focus 3.0 CMS三维适形放射治疗计划系统进行扫描图像的数字化传输、三维重建，勾画肉眼可见的病灶靶区（包括原发肿瘤和转移淋巴结GTV），上下两端分别外扩2.0～2.5cm，前后左右轴向外扩1.0～1.5cm作为临床靶区（CTV），再均匀外扩0.3～0.5cm为计划靶区（PTV），通常给予3～4个共面照射野,计算靶区及重要器官剂量分布,要求肿瘤得到处方剂量的同时确保周围正常组织受量在耐受剂量范围内。全组均采用常规分割照射2Gy/d,5F/W，总剂量50～70Gy，中位剂量64Gy。

    1．4  uPA、uPAR染色结果判定方法

    uPA蛋白阳性为肿瘤细胞浆内出现棕黄色颗粒,且其着色强度高于背景非特异性染色；uPAR蛋白阳性为肿瘤细胞膜出现棕黄色颗粒,且其着色强度高于背景非特异性染色。参考Iseki K标准[2]，根据染色强度及阳性细胞数两个方面综合判断并转化成阳性指数：a 染色强度（0=无，1=弱，2=中，3=强）；b 阳性细胞数（0=0～5%阳性染色细胞，1=5%～50%的阳性染色细胞，2=50%～100%的阳性染色细胞），a+b得分为0～1，则阳性指数为0；a+b得分为2，则阳性指数为1；a+b得分为3，则阳性指数为2；a+b得分为4、5，则阳性指数为3。综合计分<2者为阴性表达，≥2为阳性表达，综合计分≥3为强阳性表达。

    1．5  统计学方法

    利用SPSS 11.5统计分析软件包进行统计。计数资料用χ2检验或Fisher确切概率法，用KaplanMeier方法绘制生存曲线，并用 Logrank方法进行检验， COX’s比例风险模型比较不同预后因素对生存率的影响，以P<0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2．1  uPA、uPAR蛋白表达

    食管鳞癌组织、癌旁组织中uPA蛋白的阳性表达率分别为76.27%和48.78%，两者比较差异有统计学意义(χ2=8.036，P=0.005)；强阳性表达率分别为55.93%和12.20%，两者比较差异亦有统计学意义(χ2 =19.641，P=0.000)，见图1、表1。表1  食管癌和癌旁组织中uPA、uPAR蛋白表达分组总

    食管癌组织、癌旁组织中uPAR蛋白的阳性表达率分别为77.97%和43.90%，两者比较有统计学意义(χ2=12.182，P=0.000)；强阳性表达率分别为47.46%和9.76%，两者比较差异亦有统计学意义(χ2=15.801，P=0.000)，见图2、表1。

    2．2  uPA、uPAR蛋白表达与临床病理因素间的关系

    胸部CT扫描显示食管病变层面上椎前三角形间隙存在者uPA蛋白强阳性表达率为43.75%，而三角形间隙消失者强阳性表达率为70.37%，两组比较有统计学意义（χ2 =4.210，P=0.040）。发生远处转移的患者14例，其uPA蛋白阳性表达率为100%，明显高于无远处转移者的68.89%，两组比较有统计学意义（χ2=4.121，P=0.042），见表2。远处转移患者中uPAR蛋白阳性表达率为92.86% （13/14），也高于无远处转移者的73.33%（33/45），但未达到统计学意义（P>0.05）。进一步研究发现uPA、uPAR蛋白表达与患者年龄、性别、纵隔淋巴结转移、放疗后近期疗效、T分期、N分期、临床分期等均未见明显相关性（P>0.05）。而uPA、uPAR两种蛋白表达呈显著性正相关，相关系数为0.526,P=0.000。表2  食管癌uPA蛋白表达与椎前三角形间隙和远处转移的关系

    2.3  uPA、uPAR蛋白表达与生存的关系

    随访至2006年12月31日，失访2例，失访者按失访日期死亡计，随访率96.61%。随访时间3～60个月，中位随访时间31个月。放疗后近期疗效完全缓解率54.24%,部分缓解率45.76%，总有效率100%。uPA、uPAR蛋白表达对食管癌放疗后近期疗效及近期生存均未见明显影响。进一步分析发现单因素如患者年龄、X线病变长度、放疗前声音嘶哑、T分期、N分期、临床分期均与食管癌近期生存有关（P<0.05）；多因素分析显示仅T分期、N分期成为影响预后的因素，见表3。全组放疗后1、2、3年生存率分别为55.93%、38.98%、28.41%，中位生存期为15.0个月，见图3。

    3  讨论

    恶性肿瘤的重要特征是侵袭周围组织器官并在远处形成转移瘤，从而严重威胁患者生命。恶性肿瘤的侵袭、转移涉及肿瘤细胞与宿主细胞之间错综复杂的关系，受多种相关基因调控。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，是一种丝氨酸蛋白水解酶，活化的uPA除能直接作用于细胞外基质，还能激活纤溶酶，使基质中多种成分如纤维蛋白、纤维连接蛋白、

    图3  全组放疗后总生存曲线

    蛋白多糖、板层素等降解。另外，活化的纤溶酶还能激活胶原酶，使基底膜中的主要成分——胶原降解。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）一方面通过与uPA结合，提供细胞局部纤溶功能，另一方面uPAR能够介导uPA细胞内信号的传导，进而影响细胞的增殖、趋化、粘附、迁移等。

    本研究结果显示，食管鳞癌组织标本中uPA、uPAR蛋白阳性表达率显著高于其癌旁组织，随着不典型增生到癌变的形成，其蛋白表达明显升高。Hewin DF等[3]应用酶联免疫吸附法研究了18例手术切除的食管癌（10例鳞癌和8例腺癌）及正常组织uPA、uPAR蛋白的表达，结果显示鳞癌及腺癌组织中uPA及uPAR的表达水平均高于正常粘膜，这与我们的研究结果一致，提示uPA可能参与食管癌的发生与进展。

    Tang等[4]研究显示食管癌中存在uPA过度表达，但与肿瘤的分化程度及患者生存率均未见明显相关性。本组研究发现，与食管癌临床分期密切相关的因素即胸部CT扫描显示的食管病变与椎体及降主动脉之间的三角形间隙受侵时，uPA强阳性表达率较三角形间隙未受侵者明显升高，且有统计学意义，见表2。Shiomi等[5]报道uPA阳性的食管癌患者肿瘤侵袭力较强，5年总生存率明显降低。本研究进一步观察发现远处转移者uPA阳性表达率为100%，明显高于无远处转移者的68.89%，这与前期基础研究结果一致，即uPA可以通过促进细胞 表3  食管癌相关预后因素分析

    外基质蛋白的降解，参与肿瘤组织血管形成，利于肿瘤细胞转移[6]，因此认为uPA是一种加速肿瘤局部浸润及转移的蛋白水解酶，能够降解并破坏基底膜和细胞外基质，促使肿瘤细胞浸润转移。

    近年研究结果表明uPA与uPAR相互影响、相互作用。活化的uPA结合uPAR后，通过细胞膜上的相伴作用与纤溶酶原/纤溶酶原受体复合物相互靠近，激活纤溶酶原转化为纤溶酶，而活化的纤溶酶能够激活金属蛋白酶，参与细胞外蛋白水解。本研究结果显示uPA、uPAR两种蛋白表达间存在显著正相关关系。也提示了uPA、uPAR蛋白表达之间具有协同作用，可能共同参与了细胞外基质降解及肿瘤的侵袭转移。

    本研究结果还显示uPA、uPAR蛋白表达对食管癌单纯放疗的预后未见明显影响，这与Torzewski等[7]研究结果不太一致，他认为uPA强阳性表达的患者预后较差，而弱阳性及阴性表达的患者预后没有显著差别。进一步分析我们认为可能与本组病例数偏少，病例的随访时间尚短有关，目前尚没有到5年生存期。

    初步认为检测uPA、uPAR蛋白表达有助于判断食管癌侵袭转移潜能，有可能为治疗方案的制定和评估预后提供参考指标。

【参考文献】[1] 祝淑钗,李任,李娟,等.非手术治疗胸段食管癌临床分期与预后关系的初步探讨[J].中华放射肿瘤学杂志,2004,13 (3): 189192.

[2] Iseki K,Tatsuata M,Uehara H,et al.Inhibitor of angiogenesis as a mechanism for inhibitor by 1αhydroxyvitamin D3 and 1,25dihydroxyvitamin D3 of colon carcinogenesis induced by azoxymethane in Wistar rat[J].Int Cancer,1999,81(5):730733.

[3] Hewin DF,Savage PB,Alderson D,et al.Plasminogen activators in esophageal carcinoma[J].Br Surg,1996,83(8):11521155.

[4] Tang WH,Friess H,Kekis PB,et al.Serine proteinase activation in esophageal cancer[J].Anticancer Res,2001,21(4A): 22492258.

[5]Shiomi H,Eguchi Y,Tani T,et al.Cellular distribution and clinical value of urokinase type plasminogen activator,its receptor,and plasminogen activator inhibitor2 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Am Pathol,2000,156(2): 567575.

[6] Basire A,Sabarier F,Ravet S,et al.High urokinase expression contributes to the angiogenic properties of endothelial cells derived from circulating progenitors[J].Thromb Haemost,2006,95(4): 678688.

[7]Torzewski M,Sarbia M,Verreet P,et al.Prognostic signif icance of urokinasetype plasminogen activator expression in squamous cell carcinomas of the esophagus[J].Clin Cancer Res,1997,3(12 Pt 1): 22632268.