高浓度乙酸注射治疗兔 VX2 肝肿瘤的实验研究

高浓度乙酸注射治疗兔 VX2  肝肿瘤的实验研究孙志远 　丁仕义 　黄学全　　【摘要】　目的 　利用兔 V X2  肝移植瘤模型探讨高浓度乙酸注射治疗肝肿瘤的价值 ,并探索注射 治疗肝肿瘤的最适乙酸浓度。方法 　用移植法建立兔 V X2  肝肿瘤模型 ,将 40 只携瘤兔随机分为 A 、 B 、C 、D 四组 。术前以 C T 测量肿瘤直径 。开腹向 A 、B 、C 、D 组肝肿瘤内分别注入 50 % 、75 % 、100 % 乙酸和生理盐水 ,48 h 后重复注射一次 ,术后一周处死兔子取肝脏观测比较各组肿瘤体积改变情况 及坏死灶周围新生灶情况 , 并取肿瘤组织制作石蜡切片 ( H E 染色) , 镜下观察肿瘤组织坏死情况。 结果 　注射后一周各实验组肿瘤直径均减小 ,对照组肿瘤直径明显增大 。100 %乙酸组 10 例仅 1 例 在坏死灶周围发现新生灶 ,而 50 %乙酸组发现 5 例 ,75 %乙酸组发现 7 例 。镜下显示 100 %乙酸组肿 瘤中未坏死的肿瘤细胞团较 75 %和 50 %乙酸组少见 。结论 　高浓度的乙酸对兔 V X2  肝肿瘤的灭活 效果显著 ;其中 100 %的乙酸效果最佳 。　　【关键词】　肝肿瘤 　　乙酸 　　疾病模型 ,动物 　　兔Acetic acid injection f or the treatment of  VX2  l iver tumor by diff erent concentration of acetic acid : an ex2perimental study in ra bbit 　S un Z hi y ua n ,  D i n g S hi y i ,  H u an g X uequa n .  De p a rt me nt o f  R a d i ol o g y , S out h w es t  H os p i t al ,  T hi r d M i ni t a r y  M e d ic al U ni ve rs i t y ,  Chon g qi n g 400038 ,  Chi na　　【Abstract 】　Objective 　To  st udy  t he  val ue of  acetic  acid injectio n fo r  t he  t reat ment  of  liver t umo r , and explo re t he best co ncent ratio n of acetic acid.  Methods 　40 rabbit s wit h impla nted V X2  liv2 er t umo r were rando mly were divided into 4 gro up s.  Befo re t he t reat ment , t he diameter of t he t umo r s wa s acquired by C T.  The a bdo men wa s opened , and 50 % , 75 % , 100 % acetic acid o r p hysiolo gic sa2 line wa s injected into t he t umo r s of A , B , C , D gro up s , re spectively.  Af ter 48 ho ur s acetic acid were injected o nce at t he sa me do sage .  Af ter a week t he ra bbit s were killed and t he liver s were  re sected.The t umo r s’diameter  were deter mi ned and t he ca se s of  t he  rena scent  t umo r s were co unted in eachgro up .  So me t umo r ti ssue s were sampled make p araffin sectio n ( H E staining)  a nd o bserve t he necro si s of t umo r ti ssue wit h micro scop e.   Results 　1 week af ter i njectio n , t he average  dia meter of  t umo r s in each te st gro up decrea sed w hen co mpa red wit h t he co nt rol gro up .  In 100 % acetic acid2gro up , o nly 1 ca se had rena scent t umo r s near t he necro si s focus.   In 75 % acetic acid2gro up , 5 ca ses had rena scent t umo r s , and in 50 % acetic acid2gro up , 7 ca se s had rena scent t umo r s.  U nder micro scope , t he survival t umo r cell s in 100 % acetic acid2tea m were f ewer t han in 50 % acetic acid and 75 % acetic acid2gro up .Conclusions 　The eff ect of  high co ncent ratio n of  acetic acid injectio n fo r  t he t reat ment of  V X2   livert umo r in ra bbit i s significa nt , a nd 100 % acetic acid ha s t he be st eff ect .　　【Key words】　hepatic neopla sms 　　acetic acid 　　di sea se mo del s , a nimal 　　ra bbit　　经皮乙酸注射治疗 (p e rc ut a neo u s acetic aci d i njectio n , PA I) 肝癌的方法由日本学者 O h ni shi于 1994 年首先报道[ 1 ]  。该技术作为一种替代经 皮无水乙醇注射治疗 ( p e rcut a neo u s alco hol i n2jectio n , P EI) 肝癌的非血管性介入治疗方法 ,应用于临床后 , 以其明显优于后者的疗效而越来越受到医学界的关注。但由于诞生时间不长 ,许多关键性的技术问题尚待进一步完善和规范。其中关 于哪种浓度的乙酸治疗效果最佳的问题 ,一直存在争议。本研究采用兔肝接种 V X2   肿瘤 ,以三种 高浓度的乙酸用于肿瘤的灭活 ,从高浓度乙酸对肿瘤灭活的效果的角度来讨论其治疗价值 ,并探 索用于注射治疗的乙酸的最佳浓度 。1 　材料与方法1 . 1 　实验动物　　V X2  种兔由第三军医大学新桥医院放射科赠送 , 其 V X2  瘤株来源于重庆医科大学超声医学工程研究所 。接 种兔 45 只 ,新西兰大白兔 ,体重 2 . 5～3 . 0 kg ,雌雄不限 , 由本校动物所提供 。1 . 2 　试剂及仪器　　麻醉药采用 2 %戊巴比妥钠 。注射用乙酸采用成都科龙化学试剂厂生产的无水乙 酸 ,50 % 、75 %和 100 %三种浓度的乙酸实验前即刻配制 。采用 Siemens 公司 Sensatio n 16 型十六层螺旋 C T 机 进行扫描 。采用欧乃派克非离子型造影剂进行增强 。1 . 3 　实验方法1 . 3 . 1 　肿瘤模型的建立 　　采用开腹直视法种植兔 V X2  肝肿瘤。先将大腿上携瘤的种兔麻醉 ( 2 %戊巴比妥 钠经耳缘静脉注射全麻) 、大腿部瘤区消毒 、铺巾 ,切开肿 瘤 ,取肿瘤边缘区颜色鲜嫩血供丰富的组织数片 ,将其剪 成 1 mm 大小组织块 , 浸泡在生理盐水中 。将备种兔麻 醉 、备皮 、消毒后 ,沿剑突下正中作一皮肤切口 ,沿腹白线 切开腹壁 、腹膜 ,轻轻拖出肝脏一叶 , 用眼科镊夹取一小 块肿瘤组织 ,戳入肝脏 ,助手用无菌棉签轻轻压住 ,抽出 眼科镊后 ,继续压迫数十秒至伤口止血。然后轻轻将肝 脏回纳腹腔 ,缝合关腹 。每个兔肝种植 1 ～2 个瘤灶 , 每 个肝叶最多种植一个瘤灶 。　　种植后 1～3 周内以 C T 平扫和增强 ( 3 mm 层厚) 观察肿瘤的生长情况 ,待肿瘤直径长到 1 cm 左右 ( 第 15 天左右) 进行治疗试验 。1 . 3 . 2 　乙酸注射治疗试验 　　将 40 只移植成功的携瘤 兔随机分为 4 组 ,每组 10 只 ,其中 A 组为 50 %乙酸治疗 组 ,B 组为 75 %乙酸治疗组 , C 组为 100 %乙酸治疗组 ,D 组为生理盐水对照组 。各浓度乙酸实验前配制。　　实验前经 C T 平扫和增强测量肿瘤直径 。　　采用无菌操作下开腹注射治疗 。暴露肝脏后 ,可摸 到肝脏肿块 ,质硬 ,略突出于肝表面 。用 1 ml 注射器分别 向 A 、B 、C 、D 组肿块内注入浓度为 50 % 、75 % 、100 %的乙 酸和生理盐水 ( 均混入少许造影剂) , 注射的量以乙酸弥 散的范围完全覆盖并超出肿块边缘 5～10 mm 为准 ,乙酸 弥散的范围可通过肝脏颜色变黑的范围和 C T 平扫所见 造影剂弥散范围来确定。乙酸注射的速度要慢 , 约 ( 0 . 1～0 . 3) ml/ min ,以免乙酸因压力过高返流 ; 当返流明显难 以继续时 ,可适当变换进针位置 。拔针后用纱布压迫穿 刺点数分钟 , 待血液和返流的乙酸不再溢出为止 。然后 关腹 ,肌注庆大霉素抗感染 。48 h 后再次开腹 ,用与第一 次注射浓度相同的乙酸对肿瘤作第二次乙酸注射 , 乙酸 弥散的范围与上次注射相同。再次关腹 ,待实验兔继续 生长 。　　第二次注射后第 7 天处死实验兔 ,取出肝脏 ,沿肿瘤中线切开 ,观察肿瘤组织坏死情况及其周围新生灶情况 。 然后将肝脏标本用福尔马林液固定后 ,取出标本 ,将坏死 灶所在区域切成 3 mm 厚薄片若干 ,再次观察复核新生灶 情况 ,并用游标卡尺测量瘤灶 、坏死灶及新生灶大小 。取 肿瘤原发灶和新生灶做成石蜡切片 , H E 染色后镜下观察 肿瘤坏死情况 ,并确认新生灶是否为肿瘤组织 。1 . 4 　统计学处理　　根据大体标本观测结果统计各浓度组术前术后肿瘤 平均直径 、新生灶例数 、新生灶平均直径 ,利用统计软件 SPSS12 . 0 ,采用完全随机分组设计的单因素方差分析比 较术后肿瘤直径的组间差异 。2 　结果2 . 1 　大体标本观察　　肝脏坏死区域呈黑褐色 ,边界清楚 ,其边缘有一灰白 色薄带 ,为炎性浸润带 。肿瘤位于坏死灶中央 , 质地较 硬 ,呈灰白色 ,色泽暗淡 ,与治疗前色泽鲜亮的鱼肉状不 同 。其中 A 组 10 例有 7 例在坏死灶周围发现新生灶 ,B 组 10 例有 5 例发现新生灶 , C 组 10 例仅 1 例发现新生 灶 。新生灶位于坏死灶边缘或附近地带 ,呈结节状或带 状分布 ,色泽鲜亮 , 质地较硬 , 呈鱼肉状 。各乙酸组大体 标本见图 1～3 。各组治疗前后瘤灶缩小情况见表 1 。2 . 2 　镜下改变　　50 %乙酸组的肿瘤组织亦可见大片凝固性坏死 ,但 瘤灶内可找到较多未坏死的肿瘤细胞团 , 核分裂相较多 见 (见图 4) 。75 %乙酸组的肿瘤组织大部分呈凝固性坏 死 ,在排列散乱的坏死肿瘤细胞中偶可见到未坏死的肿 瘤细胞团 , 其细胞核大 , 部分可见核分裂相 ( 见图 5 ) 。100 %乙酸组的肿瘤组织呈大片凝固性坏死 ,细胞排列散 乱 ,胞膜破坏、崩解 ,胞核固缩 、碎裂或溶解 , 在排列散乱 的坏死肿瘤细胞中罕见未坏死的肿瘤细胞团 (见图 6) 。3 　讨论　　自 1994 年 O h ni shi 报道用 PA I 的方法治疗 肝癌以来 ,国内外已有诸多临床研究和动物实验 证明该方法优于 P EI[ 2 ,3 ]  。因此 , PA I 被认为是治 疗肝癌的一种很有前途的非血管介入治疗方法。 但由于诞生时间不长 ,许多技术细节有待完善。　　关于肝癌的 PA I 治疗的适宜乙酸浓度问题 , 国内外一直存在不同意见 ,造成临床应用中选用 的乙酸浓度不统一甚至混乱的现象 。　　O h ni shi 的早期动物实验[ 1 ] 发现 15 %～50 %的乙酸引起的大鼠肝脏坏死灶直径随浓度的增大 而增大比较明显 ,而 50 %以上浓度的乙酸引起的 坏死灶直径随浓度增大的幅度明显减小 ,因此认为 50 %的浓度是乙酸治疗肝癌的适宜浓度。因 而临床上很少采用高于 50 %浓度的乙酸用于治 疗 。但是国内外有学者对此提出了不同看法。吕国荣等曾提出 75 %的乙酸浓度为最适浓度[ 4 ]  。　　以上学者在探讨这个问题时都是以乙酸造成 的肝脏坏死灶大小来评价乙酸的不同浓度应用于 PA I 的效果的 。笔者认为 ,选用适宜的乙酸浓度 ,应着眼于对肿瘤的灭活达到最大效应 ,即对肿瘤造成的坏死最彻底 ( 但不至于造成严重的副反 应) 。而造成坏死的范围 ,完全可以通过调节所注 射乙酸的量来控制。至于 50 %以上浓度的乙酸 引起的坏死灶直径随浓度增大的幅度明显减小的现象 ,我们认为这是溶质扩散的物理现象 ,因为半 径与体积成立方根关系 ,那么一定浓度以上的乙 酸引起的坏死灶直径随浓度增大的幅度减小是必 然的 ,如果以浓度对坏死灶体积作曲线 ,则得到的 就是线性关系。根据以上实验现象把 50 %以上浓度的乙酸排除在治疗浓度范围以外显然是不能 令人信服的。因此 ,本实验试用高于 50 %浓度的乙酸于兔 V X2  肝肿瘤 ,观察对比其对肿瘤的灭活 效应 , 以证明更高浓度的乙酸的治疗效果优于50 %乙酸 。　　从我们的实验结果来看 ,首先 ,高浓度的乙酸 注射治疗肝肿瘤的效果是非常明显的 ,三种高浓 度的乙酸治疗后一周其肿瘤直径均有缩小 ,而对 照组肿瘤直径明显增大。其次 ,乙酸浓度的不同 造成的治疗效果的差别是明显的 。100 %乙酸组10 例仅 1 例在坏死灶周围发现新生灶 ,而 50 %乙 酸组发现 5 例 ,75 %乙酸组发现 7 例 。表明乙酸 浓度越高 ,对肿瘤组织的灭活越彻底 。　　从病理切片来看 ,各乙酸组肿瘤组织均有大 片凝固性坏死。但注射的乙酸浓度越高 ,存活的肿瘤细胞团越少见。证明不同浓度的乙酸造成的 肿瘤组织坏死程度是不一样的 ,浓度越高 ,坏死越 彻底。　　我们发现术后 1 周坏死灶附近的肿瘤新生灶 几乎总是发生在肝脏坏死灶的边缘或附近 ,推测其原因可能是较低浓度的乙酸弥散到边缘带时其 浓度已稀释至极低 ,难以杀死该处潜在的肿瘤细 胞微灶 ;如果注射的乙酸初始浓度很高 ,当其弥散 到外围时就可保持一定的浓度 ,对肿瘤细胞微灶 仍具有杀伤力 ,从而减小了新生灶生成的可能。　　O h ni shi[ 5 ] 曾经下结论说单次注射乙酸是不 可能治愈肝癌的 ,因为乙酸溶解胶原需要几小时 到一天的时间 ,在此实验之前我们曾做过一部分 单次注射的预实验 ,结果与此理论相一致 ,因为我 们所 有 单 次 注 射 的 个 例 , 乙 酸 浓 度 从 15 % ～100 % ,注射后一周坏死灶附近均发现了新生灶 。 故我们在正实验中采用二次注射治疗。从实验结 果来看 ,二次注射实验的效果明显较一次注射实验效果好 ,且更能显现不同浓度乙酸治疗效果的差异。　　从以上结果我们可以看出 ,从对肿瘤的灭活 效果的角度出发 ,100 %的乙酸应该是治疗肝癌的 最佳浓度。它造成肿瘤一定程度坏死所需注射次 数最少。如果增加注射次数 ,相信较低浓度的乙 酸也可能导致肿瘤相应程度的坏死 ,但是从技术 的角度讲 ,我们认为还是应该尽量减少注射次数 , 因为注射次数增加 ,就意味着患者承受痛苦的增 加和疗程的延长。　　不过 ,100 %的乙酸究竟能否应用于临床 ,还 需进一步探讨 。国内外学者最担心的一个问题 , 就是乙酸的肾毒性 ,因为根据以往的文献报道 ,乙 酸有肾功能损害的作用 ,而且临床上有一次性大 剂量高浓度 (50 %) 的乙酸注射导致肾功能衰竭需 血液透析治疗的报道[ 6 ]   ,因而更高浓度的乙酸应 用于临床应当非常慎重 。但是 ,从理论上探讨 ,我 们认为肝脏注射乙酸对肾功能的损害程度应该只 与注射的乙酸的溶质的量有关 ,而与乙酸浓度关 系不大 ,因为乙酸是入血液后经血循环到达肾脏 的 ,在此过程中已经稀释 ,与注入肝脏的乙酸浓度 已无太大关系 。实际上 ,在实验中我们观察到 ,乙 酸浓度越高 ,其弥散能力越强 ,覆盖肿瘤所需乙酸 剂量越小 ,因而一次注入的总溶质的量比低浓度 乙酸不会有太大增加 ; 而且利用高浓度的乙酸治 疗 ,可以减少注射次数 ,因而在一个疗程中注射的 总的溶质的量可能不会增加反而有可能减少。　　总之 ,根据本次实验结果我们认为 ,高浓度的 乙酸对兔 V X2  肝肿瘤的灭活效果是非常显著的 ; 其中 100 %的乙酸效果最佳。参考文献[ 1 ] O hni shi  K , O hya ma N ,  Ito  S , et  al .  Small  hep ato2 cell ula r carci no ma : t reat ment wit h U S guided int rat u2 mo ral injectio n of acetic acid [J ] .  Radiolo gy ,1994 ,193 (3) :747 - 752[ 2 ]  H uo  T I ,  Hua ng  YH , Wu J C , et  al .  Co mpa ri so n of p ercuta neo us  acetic  acid  injectio n  and  p ercutaneo us et hanol injectio n fo r  hepatocell ular  ca rcino ma i n cir2 r ho tic patient s : a p ro sp ective st udy[J ] .  Sca nd J  Ga s2 t roenterol ,2003 ,38 (7) :770 - 778[ 3 ] Sha h SS , J aco bs DL , Kra sinka s A M , et al .  Percuta2 neo us ablatio n of V X2  carci no ma2induced liver t umo r s wit h use of et ha nol ver sus acetic acid : pilo t st udy in a ra bbit mo del [J ] . J  Va sc  Interv Radiol ,2004 ,15 ( 1 Pt