腹腔镜胃癌根治术后腹腔冲洗液CEA mRNA的 变化和意义

腹腔镜胃癌根治术后腹腔冲洗液CEA mRNA的 变化和意义作者：青廉 余佩武 王自强 罗华星 刘伟     【摘要】  目的探讨腹腔镜胃癌根治术对腹腔脱落癌细胞的影响。  方法收集44例行腹腔镜胃  癌根治术患者胃癌切除前后腹腔冲洗液，并以RT-PCR方法检测腹腔冲洗液CEA mRNA表达情况。 结果腹腔镜胃癌根治术患者CEA mRNA表达胃癌未切除时阳性率为27.3%（12/44），切除后阳性率  为36.4%（16/44），两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。  结论腹腔镜胃癌根治术不增加腹腔胃  癌细胞的脱落。  【关键词】胃癌; 癌胚抗原; 腹腔镜; 根治性胃切除     Changes of CEA mRNA in peritoneal lavage after laparoscopy-assisted radical gastrectomy and its clinical  significanceQing Lian， Yu Peiwu， Wang Ziqiang， Luo Huaxing， Liu Wei. Department of GeneralSurgery， Southwest Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400038， China 【Abstract】 Objective  To investigate the effect of laparoscopic-assisted radical gastrectomy on gas-  tric cancer cells in peritoneal lavage fluid from patients' with gastric cancer. Methods  Peritoneal lavagefluid from 44 patients with gastric cancer was collected before and after laparoscopic-assisted radical gas-  trectomy to detect carcinoembryonic antigen （CEA） mRNA expression using RT-PCR. Results  Thepre-， and postoperative CEA mRNA positive rate was 27.3% （12/44） and 36.4% （16/44）， respective-  ly， and there was no significant difference （P>0.05）. Conclusions  Laparoscopic-assisted radical gas-  trectomy doesn't increase the intraperitoneal free cancer cells.    【Key words】  gastric cancer; CEA mRNA; laparoscopic; radical gastrectomy    自1987年腹腔镜应用于胆囊切除术以来，由  于其微创优点，应用范围逐渐扩展到外科各个领  域。腹腔镜胃癌根治术在国内外开展的手术例数  均较少，尚处于探索之中。我院自2004年3月开  始行腹腔镜胃癌根治术，术后近期效果良好 ［1-2］ 。  为探讨腹腔镜胃癌根治术是否增加腹腔脱落癌细  胞进而增加腹膜微转移，本研究收集胃癌切除前后  腹腔冲洗液检测脱落癌细胞，采用高敏感性的聚合  酶链反应（PCR）技术，选择CEA mRNA为胃癌细  胞的靶RNA， 以了解腹腔镜胃癌根治术对胃癌腹  膜微转移的影响。现报告如下: 1 材料与方法    1.1 研究对象 行腹腔镜胃癌根治术患者共44例，平均年龄作者单位: 400038 重庆，第三军医大学西南医院普通外科 通讯作者: 余佩武; 电话:（023）68754061; E-mail: yupeiwu01  @vip.sina.com  51岁（30～71岁），术前经腹部CT、电子胃镜、病  理检查证实为胃癌。其中低分化腺癌31例，中分  化腺癌10例，黏液腺癌1例，高分化腺癌2例。    1.2 标本采集 建立气腹，置入腹腔镜探查，无腹腔种植转移，  无广泛淋巴结转移、浸润，无周围脏器侵犯，可以进  行腹腔镜胃癌根治术。术前、术后分别向腹腔内注  入无菌生理盐水150 ml冲洗，轻搅动后于Douglas  抽吸约50～100 ml，1 800 r /min，离心10 min后  取沉淀。    1.3 实验方法      1.3.1 RNA提取腹腔冲洗液离心沉淀RNA  提取采用RNA抽提试剂盒（北京博大泰克生物基  因技术有限公司），操作步骤按照试剂盒说明书进  行。  1.3.2 RT-PCR上海生工生物工程技术服务  有限公司合成引物序列。CEA mRNA PCR引物 A:5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGA-  AGAAGC-3';B:5'-TCTGGAACTTCTCCTGGT-  CTCTCAGCTGG-3'，产物160 bp;内对照β-actin  引物序列:5'-GCCACATCGCTCAGACAC-3';5'-  CATCACGCCACAGTTTCC-3'，产物614 bp;按  RT-PCR试剂盒（北京博大泰克生物基因技术有限  公司）说明，在反应系统中加入总RNA 2μg，置于  42℃孵育120 min，95 ℃热变性5 min。将mRNA  逆转录成cDNA。PCR反应条件，按94 ℃ 50 s→  55 ℃ 50 s→72 ℃ 60 s循环32次，最后72 ℃ 延伸  8 min。    1.3.3  结果分析  PCR扩增后产物和β-actin  扩增后产物经含EB染色剂的2%琼脂糖凝胶电  泳，以160 bp出现阳性条带为CEA mRNA阳性，  同时614 bp出现阳性β-actin扩增后产物，为阳  性，见图1。  图1 CEA PCR电泳图    1.4 统计分析 采用SPSS 10.0统计软件包，χ 2检验（Mc-  Nemar检验），分析组间差异。 2 结果  44例行腹腔镜胃癌根治术患者，手术开始胃  癌未切除时腹腔冲洗液CEA mRNA阳性12例，  阳性率27.3% ;操作结束时阳性16例，阳性率36.  4%，术后较手术前高，但两者差异无统计学意义  （ P >0.05）。具体见表1。 表1 腹腔冲洗液CEA mRNA的检测 手术结束  手术开始 合计+ -  + 11 1 12  - 5 27 32  合计 16 28 44 McNemar检验，P>0.05。  3 讨论      腹腔镜手术具有创伤小、术后疼痛轻、胃肠功  能恢复快、住院时间短、并发症少及机体免疫功能  影响小等优点 ［3］ 。腹腔镜手术用于治疗胃恶性肿  瘤是对腹腔镜手术技术的一种挑战。1994年Kit-  ano等 ［4］ 首次报道了腹腔镜胃癌根治术，当时主要  集中在早期胃癌，术后患者恢复快，生存质量明显  优于开腹手术。早期胃癌的腹腔镜治疗取得了良  好的疗效，然而腹腔镜下进展期胃癌的根治性手术  治疗，国内外开展均较少，最大的疑问是腹腔镜胃  癌根治术是否能严格遵循癌肿切除手术的原则，包  括:①两残端无癌;②广泛清除所属淋巴引流区域  中的所有淋巴结和脂肪组织;③血管根部结扎;④  尽量减少对肿瘤组织的挤压并施行整块切除 ［5］ 。  同时由于腹腔镜手术的一些固有特点，包括操作复  杂，手术时间比开腹手术时间长。腹腔镜手术靠气  腹取得视野和操作空间。腹腔镜是否增加腹膜癌  肿播散也是外科医师关注的焦点 ［6］ 。 胃癌细胞侵犯浆膜或转移淋巴结被膜，脱落入  腹腔，称之为腹膜亚临床转移。腹腔冲洗液细胞学  检查是检测脱落癌细胞最常用的方法，但其缺点是  对微量癌细胞检测敏感性低 ［7］ ， 有较高的漏诊率，  特别是当肿瘤细胞较少并散布在炎性细胞和间皮  细胞中时，难以靠形态学检查作出诊断，而且在冲  洗液中细胞往往有较明显的退变现象，更增加了诊  断的难度。在检测肿瘤微转移方面，分子生物学方  法已经被证明是非常有用而敏感的指标。癌胚抗  原（CEA）是一种胚胎表达，正常人不表达，但伴随  着肿瘤发生可重新表达的抗原，是胃肠道肿瘤检测  的一项常用的指标。Kudera等 ［8］ 以CEA mRNA  为靶基因，用RT-PCR方法检测腹腔内肿瘤细胞，  17例RT-PCR阳性而细胞学阴性者，有5例腹膜  播散、复发，提示RT-PCR是预测胃癌复发敏感有  效的方法。RT-PCR检测胃癌患者术中腹腔冲洗  液中的CEA mRNA敏感性可达66.7% ［9］ 。Ya-  suhiro等 ［10］ 研究认为RT-PCR检测腹腔冲洗液  CEA mRNA阳性可以作为胃癌预后和腹腔复发  的有效指标。国内学者研究也认为CEA mRNA  为靶基因，用RT-PCR方法检测腹腔脱落癌细胞  是有效的方法 ［11-12］ 。 本研究采用敏感的RT-PCR方法检测腹腔镜  胃癌根治术前后的腹腔脱落胃癌细胞。手术开始  阳性率为27.3%，操作结束时为36.4%，虽然较开始有所增加，但无统计学意义（ P >0.05）。我们  认为腹腔镜胃癌根治术不会增加腹腔胃癌细胞脱  落的原因可能是:（1）由于腹腔镜有一定的放大效  应，对组织解剖更加精细;（2）超声刀有良好止血效  果，对周围组织损伤轻，局部高温有可能灭活局部  可能存在的癌细胞;（3）只需要用抓钳对少量组织  抓持进行暴露，游离过程中基本上可以不接触挤压  肿瘤组织;（4）腹腔镜手术靠气腹取得视野和操作  空间，而我们所用气腹压力较低，较开腹手术而言  对肿瘤及周围组织的机械作用小。 总之，腹腔镜胃癌根治术现在开展例数少，还  处在探索阶段，其对胃癌腹腔种植转移的长期影响  尚需要通过长期随访和多中心对照研究明确。参考文献    ［1］  余佩武，王自强，张超，等. 腹腔镜辅助下根治性胃切  除术17例临床初步报告［J］.第三军医大学学报，  2004，26（20）:1869-1871.      ［2］ 余佩武，王自强，钱锋，等.腹腔镜辅助下胃癌根治术  71例临床报告［J］.中华胃肠外科杂志，2005，8（5）:  401-403.      ［3］ Lin K M， Ota D M. Laparoscopic colectomy forcancer:an oncologic feasible option［J］. Surg Oncol，  2000，9（3）:127-134.     ［4］ Kitano S， Iso Y， Moriyama M，et al. Laparoscopic-  assisted Billroth Ⅰ gastrectomy［J］. Surg LaparoscEndosc，1994，4（2）:146-148.    ［5］ 舒晔，周总光，肖乾虎.腹腔镜手术在胃肠外科的应用［J］.临床外科杂志，1999，7（1）:39-41.      ［6］ 余佩武.腹腔镜胃癌手术的现状和进展［J］.中国微创  外科杂志，2005，5（7）:512-513.      ［7］ Abe S， Yoshimura H， Tabara H，et al.Curative re-  section of gastric cancer: limitation of peritoneal lav-  age cytology in predicticting the outcome［J］. Surg，  1995，59（4）:226-229.      ［8］ Kudera Y， Nakanishi H， Yanamura Y，et al. Prog-  nostic value and clinical implications of disseminatedcancer cells in the peritoneal cavity detected by re-  verse transcriptase chain reaction and cytology［J］.Int J Cancer，1998，79（4）:429.      ［9］ Wang J W， Lin S R， Lu C Y，et al. Gastric cancercell detection in peritoneal lavage: RT-PCR for carci-  noembryonic antigen transcripts versus the combinedcytology with peritoneal carcinoembryonic antigenlevels［J］. Cancer Lett，2005，223（1）:129-135.      ［10］ Kodera Y， Nakanishi H， Ito S，et al. Prognosticsignificance of intraperitoneal cancer cells in gastriccarcinoma: analysis of real time reverse transcriptase-  polymerase chain reaction after 5 years of followup  ［J］. J Am Coll Surg，2006，202（2）:231-236.      ［11］ 吴晴，李达，彭志海，等.检测胃癌患者腹腔冲洗液  CK19 mRNA和CEA mRNA用于预测腹膜微转移  ［J］.第二军医大学学报，2005，26（5）:492-495.      ［12］ 任峥，邹翠美，杨万勇.胃癌腹腔冲洗液癌细胞CEAmRNA表达意义的探讨［J］.宁夏医学杂志，2005，27  （1）:16-18.