CO2气腹对正常大鼠脑组织S100、 NSE mRNA和蛋白水平的影响

CO2气腹对正常大鼠脑组织S100、 NSE mRNA和蛋白水平的影响作者：徐辉 郭永章 陈训如　    作者单位：650032 成都军区昆明总医院普通外科    【摘要】  目的 研究在不同CO2气腹压及不同时段下大鼠血和脑脊液S100蛋白(S100)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平的变化对中枢神经系统的影响。方法 Wistar大鼠建立气腹模型，光镜和电镜观察大鼠脑组织胶质细胞和神经元细胞组织学变化；抗体夹心法检测血液和脑脊液中S100、NSE水平变化，RTPCR技术和免疫组织化学的方法观察脑组织中S100、NSE mRNA和蛋白水平表达的变化。结果CO2气腹后，A51组与对照组比较，海马区胶质细胞和神经元细胞均无明显变化，A102组胶质细胞和神经元细胞在光镜下呈轻度水样变，电镜下线粒体轻度肿胀；血液和脑脊液中S100、NSE在CO2气腹压力后逐渐增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)，S100和NSE在血液和脑脊液中水平变化分别呈正相关(P＜0.05)；S100、NSE mRNA在CO2气腹后逐渐增加，但与对照组比较差异无统计学意(P＞0.05)；脑组织S100、NSE表达阳性面积随气腹时间及压力增加而逐渐增加，在A51组和A102组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 在10 mm Hg 2 h范围，CO2气腹对正常大鼠中枢神经系统无损害，CO2气腹在这一范围内应用对中枢神经系统是安全的。     【关键词】  S100蛋白 神经元特异性烯醇化酶 大鼠 CO2气腹     Changes of mRNA and protein levels of S100 and neuron specific enolase in normal brain tissues of rats following pneumoperitoneun with carbon dioxide  XU Hui, GUO Yongzhang, CHEN Xunru. Department of General Surgery, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area, Kunming 650032, China    【Abstract】  Objective  To evaluate the changes of S100 protein (S100) and neuron specific enolase (NSE) of blood and cerebrospinal fluid (CSF) at different time and pressure of carbon dioxide pneumoperitoneun (CO2 PP) and explore the effect of CO2 PP on central nervous system (CNS) in normal rats. Methods  Model of CO2 PP in Wistar rats was established to observe astrocytes and neurons in the hippocamps of brian tissue of rat by light microscope and electron microscope. The changes of S100 and NSE in blood and CSF were measured by ELISA. The mRNA and protein expressions of S100 and NSE were tested by RTPCR and immunohistochemical assay. Results  There was no histologic change of hippocampus astrocytes and neurons between A51 group and control group after CO2 PP. The astrocytes and neurons in A102 group showed local hydropic degeneration under light microscope and mitochondrion swelling under electron microscope. The levels of S100 and NSE were increased in both blood and CSF samples in A51 group and A102 group after CO2 PP, without statistical difference (P＞0.05). The levels of S100 and NSE in the blood were found to be positively correlated with those in the CSF (P＜0.05). The mRNA expressions of S100 and NSE increased progressively in A51 group and A102 group, without statistical difference compared with control group (P＞0.05). The positive expression areas of S100 and NSE in the brain tissue increased progressively with increase of pressure and longer time of CO2 PP, with insignificantly statistical difference compared with control group at points of A51 and A102 (P＞0.05). Conclusion  CO2 PP at pressure of 10 mm Hg and within 2 hours is safe to CNS in rats.    【Key words】  S100 protein; Neuron specific enolase; Rats;  Carbon dioxide pneumoperitoneun     气腹对机体造成的影响是多方面、多系统、多重机制参与的，并在一定压力范围和持续时间内是可逆的。作为机体重要系统之一的中枢神经系统不可避免的受到影响，但不同CO2气腹压及不同时段是否引起脑损伤，据笔者检索目前国内外仍无相应实验及临床依据。S100蛋白(S100 protein，S100)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolse，NSE)是脑损伤的反应物，是特异性反应脑损伤的生化标志物［1-5］。本研究旨在探讨不同压力及时段下CO2气腹对S100、NSE的影响，进而探讨CO2气腹与脑损伤的关系，为临床腹腔镜CO2气腹对神经系统的安全性、可行性提供理论依据。1  材料与方法    1.1  材料    健康成年Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重(250±30)g，购自昆明总医院动物实验中心(滇实动02号)；S100蛋白单抗试剂盒、NSE单抗试剂盒美国Vector公司产品；S100蛋白ELISA试剂盒购自第四军医大学生理学教研室；NSE ELISA试剂盒购自昆明拜尔森瑞生物技术有限公司；mRNA PCR KIT购自宝生物公司；总RNA提取试剂盒及mRNA提取试剂盒MN公司产品，两对引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：NSE上游引物5'TCGAGGAGATCCCAGCCATCA3'，下游引物5'GGTGCGATGGTGCTGTTGATG3'，产物长度244 bp；S100：上游引物5'GAGCTGGAGAAGGCCATGATGGTTG3'，下游引物5'TCAAAGAACTCATGACAGGCTGTGG3'，产物长度262 bp。    1.2  方法    1.2.1  闭合法建立气腹    3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉，大鼠仰卧于手术台上，正常对照组仅于脐下向腹腔内插入12号针头，余下各组腹腔内插入12号针头后，通过气腹导管连接气腹机，充入CO2气体，腹部均匀膨胀为气腹建立成功。    1.2.2  动物分组    A组：正常对照组(假手术组)， 第2天处死， n=8； A51组： 5 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)气腹，持续时间1 h，解除气腹2 d处死，n=8；A102组：10 mm Hg气腹，持续时间2 h，解除气腹2 d处死，n=8。1.2.3  检测方法    血液和脑脊液S100、NSE用放射免疫法测定；脑组织S100、NSE mRNA检测用RTPCR技术；脑组织S100、NSE阳性细胞用免疫组化ABC法(S100单抗工作液稀释度1∶100，NSE单抗工作液稀释度1∶200)；S100、NSE的定量测定用雷卡显微镜及配套处理系统和计算机分析系统，用10×40物镜测定30 μm2面积内阳性面积。    1.3  结果分析与统计学处理    用POMS4、POMS15医学统计软件；结果以±s表示；两组比较采用t检验。2  结果    2.1  CO2气腹后脑组织海马区胶质细胞和神经元细胞的组织学变化    光镜及电镜下A51组与正常对照组比较，胶质细胞和神经元细胞胞质及胞核均无明显变化，A102组胶质细胞和神经元细胞胞质在光镜下呈灶性水样变，电镜下线粒体轻度肿胀(图1～3)。    2.2  CO2气腹后血液和脑脊液S100蛋白和NSE水平变化    S100蛋白在A51组和A102组与正常对照组比较虽有一定的增加，但差异无统计学意义，且血液和脑脊液S100蛋白水平变化呈正相关(r=0.256,P<0.05)；同样，NSE在A51组和A102组与正常对照组比较差异无统计学意义，NSE水平变化在血液和脑脊液中呈正相关(r=0.428,P<0.05)，见表1。表1  CO2气腹后血液、脑脊液S100和 NSE水平变化    2.3  CO2气腹后脑组织S100 mRNA和NSE mRNA表达变化S100 mRNA在CO2气腹后表达增加，A51组和A102组与对照组比较差异无统计学意义；同样，NSE mRNA在CO2气腹后表达虽然增加，但与对照组比较差异无统计学意义(表2)。表2  CO2气腹后正常大鼠脑组织S100 mRNA和NSE mRNA表达变化    2.4  CO2气腹后脑组织S100和NSE检测    以10×40物镜测定30 μm2面积内阳性面积：CO2气腹后48 h S100蛋白阳性表达在A51组与对照组比较无明显变化，但A102组见部分阳性细胞体增大，突起明显的数目增多；而NSE在神经元内均呈局灶性阳性表达(表3)。表3  CO2气腹后正常大鼠脑组织S100和NSE阳性面积变化3  讨论    3.1  CO2气腹对中枢神经系统组织学的影响    本研究表明，中枢神经系统组织学变化与气腹压力的高低、作用时间的长短密切相关。在10 mm Hg气腹压力、2 h时段表现为胶质细胞和神经元细胞胞质呈局灶性水样变，线粒体轻度肿胀，但无胞膜破裂或细胞核改变，为可逆性的组织学改变；免疫组化见部分胶质细胞阳性细胞体增大，突起明显的数目增多，NSE在神经元内均呈局灶性阳性表达。在5 mm Hg气腹压力、1 h范围中枢神经系统组织学无明显改变。中枢神经系统组织学变化的原因可能是CO2气腹压力的急骤升高引起急性腹腔室间隔综合征(abdominal compartment syndrome，ACS)，致脑血管阻力增加，脑血流量减少，脑皮质区灌注减少，脑静脉受压致脑血流流出部分受阻；同时，CO2气腹时CO2的吸收使PaCO2升高，使脑动静脉血氧含量差明显减少，致脑组织细胞的摄氧量不足［6］；此外，气腹压的急骤升高，亦可作为刺激因素，引起一系列的神经内分泌和交感神经反应，使血管收缩，进一步减少脑的血液供给，产生一定程度的脑缺血缺氧。在缺氧时，胶质细胞和神经元细胞内线粒体受损，使ATP生成减少，细胞膜Na＋K＋泵功能障碍，导致胞质内Na＋、水增多，使胶质细胞和神经元细胞在电镜下表现为水样变。CO2气腹在10 mm Hg压力、2 h时段对正常大鼠中枢神经系统组织学无明显影响。    3.2  CO2气腹后血液和脑脊液S100蛋白和NSE水平变化机制及意义    本研究发现，随着气腹压力及作用时间的延长，S100、NSE在血液和脑脊液中增加，S100和NSE在血液和脑脊液中水平变化呈正相关。气腹后血液和脑脊液中S100、NSE较正常对照组升高的原因：气腹致中枢神经系统一定程度的损伤，神经胶质反应性增生，重建这种自身稳定，在胶质细胞增生的同时伴有S100蛋白的浓度改变；而神经元细胞对缺血敏感，在脑缺血时，神经元细胞膜完整性的变化使细胞内大量蛋白迅速进入细胞间隙［7］，S100、NSE释放到脑脊液中并可经受损的血脑屏障进入血液，致血和脑脊液中S100蛋白、NSE升高。在A51组和A102组血液和脑脊液中S100蛋白、NSE水平均较正常对照升高，但差异无统计学意义，表明在10 mm Hg压力、2 h时段，CO2气腹对大鼠中枢神经系统生化标志物无显著影响。    3.3  CO2气腹后脑组织S100 mRNA和NSE mRNA表达机制及意义    本研究结果显示，CO2气腹后脑组织S100、NSE mRNA水平增高，提示气腹后确有脑组织S100、NSE mRNA表达的增高。CO2气腹后脑组织中NSE mRNA转录水平增高的机制可能与气腹致脑组织缺血缺氧后细胞能量代谢发生障碍，诱导了NSE基因表达有关，使基因表达的终产物NSE蛋白增加，NSE的增加加速了神经元细胞内的糖酵解途径，使ATP生成增加，以维持细胞的正常功能；而S100是星形胶质细胞内的一种酸性钙结合蛋白，在气腹致脑组织缺血缺氧时，由于兴奋性氨基酸从突触前膜释放，作用于突触后膜上的NMDA(N甲基D天冬氨酸)受体，导致［Ca2＋］i通道开放［8-9］，大量［Ca2＋］i内流，使细胞内［Ca2＋］i浓度增高，从而促使S100靶基因的表达，使S100 mRNA增加。因此，CO2气腹后血和脑脊液中S100蛋白、NSE水平升高不单纯是缺血缺氧时脑神经细胞通透性增加和破裂所致，还伴有转录水平的增高，即有基因水平的调控。但在10 mm Hg压力、2 h时段对正常大鼠中枢神经系统蛋白转录水平无显著影响。    综上所述，CO2气腹压力在10 mm Hg、2 h范围，对正常大鼠中枢神经系统组织学、生化标志物及蛋白转录水平无显著影响，CO2气腹在这一范围内应用对中枢神经系统是安全的，但对老年和/或合并慢性心、肺、脑疾患的患者及气腹时间较长者，则应警惕脑损伤的危险。【参考文献】［1］ Matsui T, Mori T, Tateishi N, et al. 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