靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用

靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用作者：杨波 脱朝伟 张宁 刘秋珍 王明耀    作者单位：100853 北京，解放军总医院南楼血液科(杨波)； 110003 沈阳，解放军第二○二医院电镜室(脱朝伟、刘秋珍、张宁)； 110042 沈阳，辽宁省肿瘤医院(王明耀) 【摘要】  目的 观察靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法 从Genebank中钓取人端粒酶催化亚单位基因hEST2的mRNA序列，通过计算机模建二级结构辅助设计并合成硫化修饰反义寡核苷酸(癌泰得)。采用人肝癌裸小鼠原位移植模型(HCMY89)。实验分为生理盐水组，5FU 10 mg/kg组，癌泰得50 mg/kg组、75 mg/kg组，癌泰得75 mg/kg联合5FU 10 mg/kg组、50 mg/kg联合5FU 10 mg/kg组。尾静脉给药，每天1次，连续20 d。观察移植瘤质量和抑瘤率、移植瘤体积、AFP浓度和移植瘤组织学。结果 (1)5FU 10 mg/kg组的抑瘤率为27.85%，其他各治疗组的抑瘤率均在42.14%～74.29%之间；(2)各治疗组瘤质量、瘤体积和AFP浓度均低于生理盐水组且差异有统计学意义；(3)瘤体积和AFP浓度之间呈直线关系，为显著正相关(r=0.997 7)；(4)癌泰得和5FU治疗人肝细胞癌后，肝癌细胞出现不同程度的凋亡、坏死，同时伴有纤维组织增生。结论 癌泰得对肝癌细胞生长具有抑制作用，疗效优于5FU；与5FU合用具有协同抗肿瘤效应。 【关键词】  端粒酶催化亚单位；反义寡核苷酸；原发性肝细胞癌；原位移植；裸小鼠；疾病模型　　Inhibitory effect of antisense oligodeoxynucleotide targeted against telomerase catalytic subunit gene hEST2 on the growth of human hepatocellular carcinoma cells 　　YANG Bo, TUO Chaowei, ZHANG Ning, LIU Qiuzhen, WANG Mingyao.　　Department of Hematology, General of PLA, Beijing 100853, ChinaCorresponding author: TUO Chaowei, Department of Electron Microscopy, No. 202 Hospital of PLA, Shenyang 110003, Email: yangsongru312@163.com    【Abstract】  Objective  To investigate the inhibitory effect of antisense oligodeoxynucleotide targeted against telomerase catalytic subunit gene hEST2 on the growth of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. Methods  mRNA sequence of hEST2 was obtained from Genebank database. Computer was applied in helping imitate the secondary structure of mRNA and design antisense oligodeoxynucleotide. Chemosynthesis method was used to synthesize the sulfurized antisense oligodeoxynucleotide targeted against hEST2 (Cantide). Orthotopic implantation model of hepatocellular carcinoma in nude mice (HCMY89) was established. All mice were divided into normal saline group (negative control), 5FU 10 mg/kg group (positive control), Cantide 50 mg/kg group, Cantide 75 mg/kg group, Cantide 75 mg/kg plus 5FU 10 mg/kg group, Cantide 50 mg/kg plus 5FU 10 mg/kg group. Vena caudalis injection was done on all mice once per day for 20 days continuously to observe weight, volume, histology and inhibition rate of implanted tumors, AFP concentration. Results  (1) Inhibition rate of tumor was 27.85% in 5FU 10 mg/kg group but 42.14%74.29% in other groups. (2) In the treatment group, the tumor had lighter weight, smaller volume and lower AFP concentration than those in normal saline group. (3) AFP concentration had a positive correlation with tumor volume (r=0.997 7). (4) Apoptosis and necrosis of cancer cells and proliferation of fibrous tissue were observed after treating HCC by 5FU and Cantide. Conclusions  Cantide has an inhibitory effect on HCC and is much better than 5FU in antitumor effect. Cantide combined with 5FU has a synergistic antitumor effect.    【Key words】Telomerase catalytic subunit;  Antisense oligodeoxynucleotide;  Primary hepatocellular carcinoma;  Orthotopic implantation;  Nude mice;  Disease model    端粒是由端粒酶合成的真核细胞染色体末端独特的蛋白质DNA结构。它具有保持染色体稳定性和维持细胞正常复制的功能。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核蛋白复合体，其中具有逆转录酶活性的hEST2催化亚基的表达是细胞调节端粒酶活性的主要限速步骤。由于端粒酶催化亚基结构和功能的特殊性，它是反义核酸药物治疗肿瘤的良好靶点。本文观察了靶向端粒酶催化亚单位基因hEST2反义寡核苷酸药物癌泰得对人肝癌生长的抑制作用。1  材料与方法　　1.1  实验动物    BALB/Cnu/nu裸小鼠由中国医学科学院协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院实验动物室提供，质量合格证编号为SCXK000005。鼠龄3～5周，体质量17～20 g，雌雄兼用，在解放军第二○二医院裸鼠室内SPF(specificpathogen free)条件下饲养，许可证编号为SYXK(军)2002020(三级)。　　1.2  瘤株来源及原位移植［1］    人肝癌裸小鼠原位移植高转移模型(HCMY89)由解放军第二○二医院卫生部人类消化系恶性肿瘤裸鼠原位移植瘤株中心提供。无菌切取移植瘤的瘤组织，置入RPMI1640培养液中，将其剪切成约为1 mm×1 mm×1 mm组织小块，供移植用。裸鼠在0.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉下取右季肋缘下行长1 cm的斜切口，暴露肝脏。在肝左叶被膜处行2 mm长切口，经切口将1粒1 mm×1 mm×1 mm瘤组织植入肝实质内，75%乙醇浸湿纱布压迫止血，100无损伤线缝合肝被膜，将肝放回原位，70丝线缝合腹膜，50丝线缝皮。　　1.3  主要试剂    氟尿嘧啶(5FU)注射液250 mg/10 ml，为上海第十二制药厂产品；癌泰得25 mg/支，粉针剂，由中国军事医学科学院北京放射医学研究所九室合成［2］。　　1.4  实验分组及给药    根据小鼠急性毒性实验，癌泰得LD50>500 mg/kg，>100 mg/kg可见肝酶水平轻微升高及轻度PLT减少。原位移植术后将48只荷瘤裸鼠随机分成生理盐水组，5FU 10 mg/kg组，癌泰得50 mg/kg组、 75 mg/kg组， 癌泰得75 mg/kg联合5FU 10 mg/kg组(联合1组)、50 mg/kg联合5FU 10 mg/kg组(联合2组)， 共6组， 每组8只。尾静脉给药，1次/d，连续20 d。停药后第3天用颈椎脱位术处死荷瘤裸鼠。　　1.5  观察项目　　1.5.1  移植瘤质量和抑瘤率：处死动物，剖取瘤块，用天平称移植瘤质量，按以下公式计算抑瘤率。    抑瘤率(%)=(1-治疗组平均移植瘤质量/生理盐水对照组平均移植瘤质量)×100%　　1.5.2  移植瘤体积：用游标卡尺测出移植瘤最大径线(A)及最小径线(B)，按照以下公式计算移植瘤体积。    移植瘤体积(V)=1/6×π×(A+B2)3　　1.5.3  AFP浓度： 实验结束时， 对荷瘤裸鼠行眼静脉丛采血， 应用放射免疫法定量测定血清AFP浓度。　　1.5.4  组织学检查：移植瘤块经10%甲醛溶液固定，石蜡切片，苏木精伊红染色，光镜观察。　　1.6  统计学分析    数据用SPSS 11.5统计软件处理；移植瘤质量、移植瘤体积、AFP浓度均以±s表示；各组间比较采用t检验；对瘤体积和AFP浓度进行直线相关和回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。协同作用统计分析采用金正均法计算q值：    q=Ea+Eb［Ea+(1-Ea)Eb］，Ea为A药抑瘤率，Eb为B药抑瘤率。q<0.85为两药拮抗；0.85≤q≤1.15为两药相加；q>1.15为两药协同。2  结果　　2.1  癌泰得对人肝癌裸鼠原位移植瘤质量和抑瘤率的影响    生理盐水组及各治疗组的移植瘤质量、抑瘤率及其比较见图1，2。协同作用分析结果为：联合1组的q值等于0.93，说明癌泰得75 mg/kg与5FU 10 mg/kg两药作用相加；联合2组的q值等于1.28，说明癌泰得50 mg/kg与5FU 10 mg/kg两药作用协同。　　2.2  癌泰得对人肝癌裸鼠原位移植瘤体积的影响    生理盐水组及各治疗组的移植瘤体积及其比较见图3。　　2.3  癌泰得对人肝癌裸鼠原位移植瘤分泌AFP的影响    实验中所用的人肝癌裸鼠原位移植高转移模型具有保持分泌AFP阳性的特点。AFP阳性是该模型移植成功的重要指标，同时也可以作为药物对肝癌抑制作用的动态观察指标。实验中观察了癌泰得对该模型分泌AFP浓度的影响见图4。　　2.4  移植瘤体积和AFP浓度的直线回归和相关分析    直线回归分析表明，瘤体积和AFP浓度之间有直线关系(图5)；AFP浓度对瘤体积的直线回归方程为：Y=-127.17+1.10X(b=1.10，P<0.001)。直线相关分析表明，瘤体积与AFP浓度呈显著正性直线相关(r=0.997 7，P<0.001)。　　2.5  移植瘤组织病理检查    各实验组移植瘤组织病理学观察结果见图6～9。3  讨论    癌生物学的研究为癌的防治提供了新的靶点。端粒酶是近年发现的恶性肿瘤的特异性标志物。大量基础和临床研究表明，端粒酶是恶性肿瘤诊断和治疗的重要潜在靶点。本研究发现，癌泰得对肝癌的抑制作用优于5FU，癌泰得75 mg/kg组的抑瘤作用强于50 mg/kg组，呈现量效关系。    值得提出的是，反义寡核苷酸癌泰得与抗代谢细胞毒药物5FU合用对肝癌的抑制具有相加或协同作用。近来有研究表明，端粒酶活性抑制可以增加癌细胞对化疗药物的敏感性。但是这方面的报道非常有限。Kondo等［3］研究发现，在体内或体外条件下，以hTER为靶的25A反义寡核苷酸抑制恶性神经胶质瘤细胞的端粒酶活性后，瘤细胞对顺铂的敏感性增加。而这种两药协同作用在对黑色素瘤、乳腺癌、永生化成纤维细胞和myc/Ras转染的鼠胚成纤维细胞的实验中并未观察到［46］。端粒酶活性抑制与依托泊苷(或阿霉素)的协同抗瘤作用已在乳腺癌细胞和永生化成纤维细胞观察到［5］，但在黑色素瘤无协同效应［4］。Elmore等［7］报道，阿霉素对乳腺癌细胞系MCF7的强抑制作用与端粒功能异常有关，而与端粒长度无关。本研究进一步证实端粒酶抑制剂与细胞毒化疗药物联合应用具有协同抗肿瘤效应。    5FU是抗代谢类抗肿瘤药，属于细胞周期特异性药物，主要作用在S期。根据目前的研究结果，端粒酶活性的调节是细胞周期依赖性的。细胞周期不同阶段，端粒酶活性也不同。端粒酶活性在G1/S期进行性增加并于S期达到最高，在G2/M期活性几乎测不到。这提示端粒酶维持端粒功能可能在S期处于活化状态，而非复制期处于静止状态。因此，癌泰得抑制端粒酶活性在S期作用最显著。所以，癌泰得与5FU合用主要是抑制增殖期肝癌细胞。这已通过对移植瘤体积和AFP浓度的观察得到证实。    本研究所应用的人肝癌裸小鼠原位移植高转移模型具有保持分泌人AFP阳性的特点。AFP分泌量与两个主要因素有关，即肝癌的分化程度和肝癌细胞群中处于增殖状态的肝癌细胞比例。分化高的AFP含量少，分化低的AFP含量高；肝癌细胞群中处于增殖状态的肝癌细胞比例高，AFP分泌量高，反之，AFP分泌量低。该模型中移植瘤体积可以大致反映增殖状态的肝癌细胞比例。增殖状态的肝癌细胞比例增大，移植瘤体积也增大。本研究观察到，AFP浓度随移植瘤体积的增大而上升；直线回归和相关分析显示，两者有直线关系，且呈正相关。这与临床上观察到的现象一致。上述结果表明：癌泰得和5FU均能够杀伤具有分泌AFP功能的增殖状态的肝癌细胞；动态观察AFP水平变化对临床疗效的判定、病情进展和预后估计具有重要参考价值。【参考文献】　　［1］刘秋珍,脱朝伟,张宁.人脾原发性恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植模型的建立及其生物学特性的研究.中华肿瘤杂志,2002,24:(3):234-238.　　［2］Yang Y, Lv QJ, Du QY, et al. Combined effects of cantide and chemotherapeutic drugs on inhibition of tumor cells′ growth in vitro and in vivo. World J Gastroenterol,2005,11(16):2491-2496.　　［3］Kondo Y, Komata T, Kondo S. Combination therapy of 25A antisense against telomerase RNA and cisplatin for malignant gliomas. Int J Oncol,2001,18(6):1287-1292.　　［4］Folini M, DeMarco C, Orlandi L, et al. Attenuation of telomerase activity dose not increase sensitivity of human melanoma cells to anticancer agents. Eur J Cancer,2000,36(16):2137-2145.　　［5］Ludwig A, Saretzki G, Holm PS, et al. Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase. Cancer Res,2001,61(7):3053-3061.　　［6］Lee KH, Rudolph KL, Ju YJ, et al. Telomere dysfunction alters the chemotherapeutic profile of transformed cells. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(6):3381-3386.　　［7］Elmore LW, Rehder CW, Di X, et al. Adriamycininduced senescence in breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction. J Biol Chem,2002,277(38):35509-35515.