蛙皮素对胆道梗阻大鼠肝脏氧化应激的影响

蛙皮素对胆道梗阻大鼠肝脏氧化应激的影响作者：陆培华 时开网 刘子君 杨坤兴　    作者单位：210006 南京医科大学附属南京第一医院普外科中科院    【摘要】  目的 探讨蛙皮素对胆道梗阻大鼠肝脏氧化应激的影响。方法 40只Wistar雄性大鼠随机分成4组：正常组、假手术组、黄疸组、蛙皮素组。术后第10天，下腔静脉检测血ALT、LPS水平，肝脏表达SOD、MDA、XOD、GSH衡量氧化应激状态，光镜下观察肝脏组织结构。结果 胆道梗阻下腔静脉ALT、LPS值升高， 肝脏SOD、GSH表达减少， MDA、XOD表达增加， 组织炎性细胞浸润较多， 肝脏高氧化应激。蛙皮素注射10 d，血清ALT、LPS水平及组织炎性细胞浸润减少，肝脏高氧化应激状态降低。结论 蛙皮素降低胆道梗阻大鼠肝脏氧化应激，其机制可能与肝脏蛋白激酶C、LPS水平及炎性细胞浸润有关。     【关键词】  蛙皮素 氧化应激 胆道梗阻 肝脏 大鼠     Experiment study on bombesin affecting hepatic oxidative stress and its mechanism in rats with bile duct obstruction  LU Peihua, SHI Kaiwang, LIU Zijun, YANG Kunxing. Department of General Surgery, First Hospital of Nanjing, Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China   【Abstract】  Objective  To evaluate the effect and mechanism of bombesin (BBS) on hepatic oxidative stress in rats with biliary tract obstruction. Methods  Forty male Wistar rats were randomly divided into four groups, ie, control group, sham operation group, bile duct ligation (BDL) group and BDL+BBS group. Ten days after operation, serum ALT and LPS levels were determined in inferior caval blood. Hepatic oxidative status was estimated on liver homogenates by measuring SOD, MDA, XOD and GSH. Meanwhile, liver tissue samples were examined histologically. Results  ALT and LPS were elevated in rats with biliary tract obstruction, which was accompanied by decrease of SOD and GSH and increase of MDA and XOD. Moreover, neutrophil accumulation in portal tracts was significantly increased, with liver in high oxidative stress status. Ten days after BBS administration, there could be seen reduced ALT and caval endotoxaemia, decreased neutrophil infiltration and degraded oxidative stress of the liver. Conclusion  BBS can degrade oxidative stress of the liver, which may be associated with LPS level, protein kinase C activity and neutrophil accumulation.   【Key words】  Bombesin; Oxidative stress; Bile duct ligation; Liver; Rats    蛙皮素(bombesin,BBS)是一种与人体内胃泌素释放肽的结构和功能都十分相似的14肽物质，具有促进胃肠激素分泌及肠黏膜上皮细胞增殖的作用。近年研究发现其有抗氧化损伤，保护肠道黏膜的作用［1］。高氧化应激也是胆道梗阻肝脏损伤的重要原因［2］。为此我们设计本实验探讨蛙皮素对胆道梗阻肝脏氧化应激的影响。1  材料与方法    1.1  实验动物及试剂    Wistar雄性大鼠40只，体重230～250 g，购自上海实验动物中心。蛙皮素(［Lys3］Bombesin，型号B1647)及牛血清白蛋白购自Sigma公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。    1.2  试剂配制    首先用0.1%牛血清白蛋白1 ml溶解1 mg蛙皮素，然后用含0.25%牛血清白蛋白的生理盐水稀释成200 ml，分装后-20 ℃保存。    1.3  实验设计    大鼠随机分成4组：正常组、假手术组、黄疸组、蛙皮素组，每组各10只。均严格无菌操作，用氯胺酮(50 mg/kg)麻醉。取上腹正中切口约2～3 cm，解剖肝蒂，假手术组仅游离胆总管后关腹。黄疸组、蛙皮素组在距肝门0.5 cm处用40丝线双道结扎胆总管，制成胆道梗阻模型［3］。正常组不作任何处理。    术后第1天起，蛙皮素组按3次/d皮下注射10 μg/mg蛙皮素溶液0.5 ml，正常组、假手术组、黄疸组按3次/d皮下注射生理盐水0.5 ml。术后第10天，各鼠留取下腔静脉血约2 ml、肝脏约0.5 g后，放血使其死亡。    1.4  检测指标    1.4.1  谷氨酸氨基转移酶(ALT)、内毒素(LPS)    血清ALT值由日本Olympus AU2700全自动生化检测系统检测；LPS水平按凝固蛋白引起的浊度变化进行定量，由北京金山川公司MB80微生物快速动态检测系统检测。    1.4.2  SOD、MDA、XOD、GSH    准确称取肝脏组织0.5 g按质量体积比1∶9加入生理盐水，制成10%的匀浆，2 500 r/min，离心10 min，再用生理盐水稀释成0.1%的组织匀浆待测。参照试剂盒说明书，SOD用黄嘌呤氧化酶法，按每毫升匀浆蛋白在1 ml反应液中抑制率达50%时对应的SOD量为一个活力单位。MDA通过改良TBA法，定量每毫克肝脏匀浆所含MDA值。XOD用四唑盐比色法，按每克组织蛋白在37 ℃每分钟转化为1 μmol底物所需的酶量为一个酶活力单位。GSH通过与DTNB反应生成一种黄色化合物比色法定量每毫升匀浆中GSH值。处理好的标本用分光光度计检测。    1.5  光镜切片的制备观察    新鲜肝脏组织用福尔马林固定、石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜观察肝脏汇管区小胆管数量，炎性细胞浸润及胆管上皮增殖程度。    1.6  统计学分析    实验数据用SPSS 11.5统计软件处理，计量资料以±s表示，组间比较以Levene's检验，方差齐性后使用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  一般情况    手术顺利，所有大鼠术后第10天存活良好，未有胆瘘发生。    2.2  血清ALT、LPS    ALT值黄疸组与正常组、假手术组相比显著升高(P<0.05)，蛙皮素组较黄疸组降低(P<0.05)，见图1。LPS值黄疸组较正常组、假手术组显著升高(P<0.001)，蛙皮素组则较黄疸组明显降低(P<0.01)，正常组和假手术组之间差异无统计学意义(图2)。    SOD活力黄疸组较正常组、假手术组显著降低(P<0.001)，蛙皮素组较黄疸组增高(P<0.05)，见图3。MDA含量黄疸组较正常组、假手术组增加(P<0.05)，蛙皮素组较黄疸组明显降低(P<0.05)，见图4。XOD活力黄疸组较正常组、假手术组明显增加(P<0.05)，蛙皮素组较黄疸组减少(P<0.05)，见图5。GSH含量黄疸组较正常组、假手术组显著减少(P<0.001)，蛙皮素组较黄疸组增加(P<0.05)，正常组和假手术组之间差异无统计学意义(图6)。    2.4  光镜下肝脏病理组织学改变    黄疸组大鼠肝脏汇管区胆管上皮增生、小胆管数量增加、炎性细胞大量浸润，肝细胞可见肿胀坏死(图7)。蛙皮素组注射蛙皮素后胆管上皮增生、小胆管增加、炎性细胞浸润程度比黄疸组轻，肝细胞肿胀坏死较少(图8)。3  讨论    胆道梗阻肝脏胆汁淤滞，线粒体呼吸链损害，产生自由基渗漏及激活氧自由基的炎性细胞增加。活性氧通过电子传递直接氧化细胞的脂质、蛋白质、核酸及糖类，造成可致肝脏受损的高氧化应激［2］。    我们实验发现胆道梗阻10 d，大鼠血清ALT、LPS水平明显升高，汇管区胆管上皮增殖、小胆管数量增加、炎细胞大量浸润，肝脏呈高氧化应激。SOD和GSH是低分子自由基清除剂，后者除直接和氧自由基反应保护细胞膜中含巯基蛋白不被氧化外，还可作为GST及GSHPx等GSH相关酶的底物。GSHPx能还原已生成的有机羟过氧化物，GST可催化GSH与过氧化物结合转变为高氧化状态的GSSG。脂质氧化指标MDA及体内核酸代谢酶XOD升高加重肝脏氧化应激，XOD可早于ALT释放入血，反应肝脏氧化损伤。    与黄疸组相比，实验中注射蛙皮素后，大鼠血清ALT、LPS水平降低，汇管区胆管上皮增殖、小胆管数量增加及炎细胞浸润程度减轻，以SOD、GSH增加，MDA、XOD减少，表现为肝脏氧化应激降低。蛙皮素降低肝脏氧化应激状态，发挥抗氧化效应机制可能和直接的受体介导有关，通过抑制肝脏活性氧簇的形成和增加细胞内信号通路发挥作用［4］。蛙皮素和特殊的G蛋白藕联受体结合后激活大量蛋白激酶C，促使线粒体易位及抗氧化物酶系统形成，增加细胞对高氧化的毒性耐受，保护肝细胞膜的完整。蛋白激酶C在胆道梗阻损伤中的作用已经证实［5］。DalPizzol等［6］用蛙皮素受体拮抗剂与蛙皮素受体结合后，同样产生大量蛋白激酶C，发挥类似蛙皮素的肠黏膜保护效应，从另一个角度证实蛙皮素受体蛋白激酶C通路的存在。    LPS是潜在的全身炎症反应激活剂，可促使大量细胞介质和炎性因子的释放，促使核因子κB过表达，激活IL6、IL8、TNFα基因转录，后者通过黄嘌呤氧化酶通路大量生成氧自由基加重肝脏氧化应激。内毒素血症主要由肠黏膜屏障破坏细菌大量易位所致，蛙皮素可降低肠氧化应激保护肠黏膜完整，减少内毒素吸收，控制内毒素血症的发生［1，3］，减轻对肝脏的氧化应激［7］。LPS还可上调肝脏诱生型一氧化氮合酶的表达，过表达的NO和氧化环境下氧负离子结合形成NO-3，遇H+形成强氧化剂硝酸，后者与氧自由基协同使肝脏处于高氧化应激状态。    此外，胆道梗阻汇管区浸润的炎性细胞接触抗原产生大量氧自由基加重肝脏氧化应激，内毒素和淤滞的胆汁可能是肝脏炎性细胞浸润的重要因素［8］。长期胆汁淤滞使汇管区趋聚的炎性因子还可刺激胆管大量合成细胞生长因子，诱导胆管上皮过度增殖以及小胆管数量增加。肝脏结构改变可能也是其高氧化应激损伤的一方面。蛙皮素通过减少汇管区炎性细胞数量、黏附分子的表达及炎性因子的趋化性保护肝脏正常的组织结构，减轻肝脏氧化应激。蛙皮素还可改善肝脏微循环，减轻低氧和能量衰竭导致的高氧化应激。    蛙皮素能降低胆道梗阻大鼠肝脏氧化应激状态，其机制可能是多方面的，与肝脏蛋白激酶C、LPS水平及炎性细胞浸润都有关，虽然机制有待进一步阐明，但这一发现可能为临床梗阻性黄疸围手术期处理和器官功能保护提供一种新的方法。【参考文献】  ［1］ Assimakopoulos S F, Scopa C D, Zervoudakis G, et al. Bombesin and neurotensin reduce endotoxemia, intestinal oxidative stress, and apoptosis in experimental obstructive jaundice［J］. Ann Surg,2005,241(1):159-167.  ［2］ Brown K M, Brems J J, Moazzam F N, et al. The nitric oxide donor molsidomine improves survival and reduces hepatocyte apoptosis in cholestasis and endotoxemia［J］. J Am Coll Surg,2003,197(2):261-269.  ［3］ Giacometti A, Cirioni O, Ghiselli R, et al. Amphibian peptides prevent endotoxemia and bacterial translocation in bile ductligated rats［J］. Crit Care Med,2006,34(9):2415-2420.  ［4］ Assimakopoulos S F, Vagianos C E, Zervoudakis G, et al. Gut regulatory peptides bombesin and neurotensin reduce hepatic oxidative stress and histological alterations in bile duct ligated rats［J］. Regul Pept,2004,120(1-3):185-193.  ［5］ Wang J M, Wang H, Xu L N, et al. Hepatic injury in rats with obstructive jaundice: roles of the protein kinase C signal pathway and cytoprotection of fructose［J］. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2005,4(4):577-581.  ［6］ DalPizzol F, Di Leone L P, Ritter C, et al. Gastrinreleasing peptide receptor antagonist effects on an animal model of sepsis［J］. Am J Respir Crit Care Med,2006,173(1):84-90.  ［7］ Houdijk A P, Oosterling S J, Siroen M P, et al. Hypertaurinemia in bile ductligated rats after surgery: the effect of gut endotoxin restriction on organ fluxes and oxidative status［J］. JPEN J Parenter Enteral Nutr,2006,30(3):186-193.  ［8］ Robin M A, Prabu S K, Raza H, et al. Phosphorylation enhances mitochondrial targeting of GSTA44 through increased affinity for binding to cytoplasmic Hsp70［J］. J Biol Chem,2003,278(21):18960-18970.