端粒酶、P16、RB、PCNA在胰腺癌组织中的表达及意义
发表时间：2010-01-18 浏览次数：589次
端粒酶、P16、RB、PCNA在胰腺癌组织中的表达及意义作者：许元鸿 欧阳兵 于国志 郭仁宣 郭克建 作者单位：110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院普通外科 【摘要】 目的 探讨端粒酶活性、P16、RB、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在胰腺癌组织中的表达及意义。方法 对39例胰腺癌及11例胰腺良性病变采用PCRTRAP方法检测端粒酶活性，免疫组化SP法定位观察P16、RB、PCNA表达。结果 端粒酶、P16、RB、PCNA标记指数(labeling index,LI)在胰腺癌中表达阳性率分别为92.3%(36/39)、43.6%(17/39)、71.9%(28/39)、(47.8±11.3)%。与胰腺良性病变比较差异有统计学意义(P<0.05)。端粒酶阳性、P16和RB表达缺失者PCNA LI显著增高(P<0.05)。端粒酶活性与P16表达、P16与RB表达均呈显著负相关(P<0.05)。P16/RB失活组端粒酶阳性率显著高于P16阳性/RB阳性组(P<0.05)。P16表达缺失和PCNA高值组临床病期较晚，更易发生淋巴结转移(P<0.05)。结论 端粒酶激活、P16、RB表达缺失在胰腺癌发生中起重要的调节作用，而且是促进细胞增殖重要因素之一。P16表达缺失与胰腺癌的转移和浸润可能有密切关系。 【关键词】 胰腺肿瘤； 端粒酶； P16； RB； PCNA； 基因 Expressions of Telomerase, P16, RB and PCNA in pancreatic cancer tisseus and their significance XU Yuanhong, OUYANG Bing, YU Guozhi, GUO Renxuan, GUO Kejian. Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China Corresponding author: XU Yuanhong, Email: yuanhongxu@hotmail.com 【Abstract】 Objective To investigate expressions of significance of telomerase, P16, RB and PCNA in pancreatic cancer tissues and their significance. Methods Expressions of P16, RB and PCNA in tissues from 39 cases with pancreatic cancer and 11 benign leisions were observed by means of immunohistochemical method. In the meantime, telomerase activity was investigated by using telomeric repeat amplification protocal (TRAP) assay. Results The positive expression rate of telomerase, P16, RB, PCNAL1 in pancreatic cancer tissues were 92.3%, 43.6%, 71.9% and (47.8±11.3)%, respectively, with statistica difference compared with benign leisions (P<0.05 or P<0.01). The cases with expression deletion of telomerase activation, P16 and RB showed significanty higher level level PCNA LI （P<0.05）. There found negative correlation between expression of P16 and that of RB as well as expression of telomerase and that of P16 (P<0.05). The positive rate of telomerase in P16/RB deletion group was significantly higher than that in P16+/RB+ group (P<0.05). The expression deletion of P16 and high level of PCNA were correlated closely with lymph node metastasis (P<0.05). Conclusions Telomerase activation, expression deletion of P16 and RB genes may be important molecular event in occurrence of pancreatic cancer and is one of vital factors pomoting cell proliferation. The loss expression of P16 is probably correlated closely with infiltration and metastasis of pancreatic cancer. 【Key words】 Pancreatic cancer; Telomerase; P16; RB; PCNA; Gene 端粒酶、p16、RB是调控肿瘤细胞永生化和癌变的重要基因，与肿瘤细胞增殖失控、转移和浸润关系密切［1-3］。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作为肿瘤群体增殖动力学参数对研究肿瘤生物学行为有很高价值［4］。本文应用PCRTRAP和免疫组化染色对胰腺癌的端粒酶、P16、RB、PCNA进行检测，探讨它们在胰腺癌的发生、转移和浸润中的作用及相互关系。1 材料与方法 1.1 材料 39例胰腺癌(31例导管细胞癌、3例浆液性囊腺癌、3例黏液性囊腺癌、2例胰岛细胞癌)，11例胰腺良性病变(6例胰腺囊腺瘤、1例胰腺腺瘤、4例慢性胰腺炎)，均取自中国医科大学第一临床学院和辽宁省肿瘤医院1998年5月至1999年10月手术切除标本。 1.2 试剂 TRAP端粒酶检测试剂盒购自美国Intergen公司；Taq酶购自日本Takara公司；P16、RB多克隆抗体、PCNA单克隆抗体、生物素标记的二抗购自北京中山生物技术有限公司；SP试剂盒购自ZYMED公司。 1.3 方法 (1)端粒酶检测：取组织标本50～100 mg用液氮在高压消毒过的研钵中研成粉末，转入2 ml玻璃匀浆器，加入200 μl 1×CHAPS裂解液制成匀浆，冰上孵育30 min，4 ℃以下12 000 r/min离心20 min，取上清液，以液氮速冻后置-80 ℃保存备用。 PCRTRAP方法检测：25 μl反应体系中DEPC水19.8 μl，10×TRAP缓冲液2.5 μl，50×dNTPs 0.5 μl，TS引物0.5 μl，TRAP混合引物0.5 μl，Taq酶0.2 μl(1 u)，最后加入端粒酶提取液1 μl。TS引物在端粒酶介导下30 ℃延伸30 min，混匀后在热循环仪上进行35个循环的PCR反应，循环条件为：94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min。 选用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，以250 V电压电泳30 min左右，取下凝胶，经EB染色后，在GDS8000UPV成像仪上观察，保存所得图像。 结果判定：如果在内对照带以外，出现其间隔6 bp的梯带，则判断为端粒酶阳性；如果只有内对照带，则为端粒酶阴性。 (2)P16、RB、PCNA表达：免疫组化染色方法SP法：按说明书严格操作。 结果判定：以已知阳性切片作阳性对照，用PBS代一抗作阴性对照。RB、PCNA阳性物质定位于细胞核；P16定位于胞质。PCNA标记指数(labeling index,LI)=阳性细胞数/500(双盲法，记数500个肿瘤细胞，5个高倍视野，取均值)。 1.4 统计学分析 数据采用χ2检验、t检验和Spearman等级相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 端粒酶、P16、RB、PCNA在胰腺良、恶性病变中的表达(表1、图1～4)表1 端粒酶、P16、RB在胰腺良、恶性病变中的表达 2.2 端粒酶、P16、RB表达与PCNA LI的关系(表2)表2 端粒酶、P16、RB与PCNA表达间的关系 2.3 端粒酶、P16、RB表达间的相互关系 端粒酶阳性/P16阳性者14例，端粒酶阳性/P16阴性者22例，端粒酶阴性/P16阳性者3例，端粒酶阴性/P16阴性者0例，Spearman相关分析检验r＝-0.794 3，P<0.05。 端粒酶阳性/RB阳性者26例，端粒酶阳性/RB阴性者10例，端粒酶阴性/RB阳性者2例，端粒酶阴性/RB阴性者1例，r=-0.543 2，P>0.05。 P16阳性/RB阳性者6例，P16阳性/RB阴性者11例，P16阴性/RB阳性者22例，P16阴性/RB阴性者0例，r=-0.874 9，P<0.01。 P16/RB失活组共计33例，32例表达端粒酶阳性，占96.9%；P16阳性/RB阳性组共计6例，1例表达端粒酶阳性，占16.6%，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。 2.4 端粒酶、P16、RB、PCNA表达与胰腺癌分化、临床分期和转移的关系(表3)表3 端粒酶、P16、RB、PCNA表达与胰腺癌相关指标的关系3 讨论 1989年Morin等首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，肿瘤细胞永生化的“端粒端粒酶”假说已被越来越多的研究成果所证实。认为人体细胞的死亡过程有两种程序控制，即第一致死期M1期和第二致死期M2期，M1期由P53、P16、RB等正常抑癌基因所产生的蛋白控制，M2期由端粒酶控制［5］。由此可见端粒酶、P16、RB基因表达的蛋白在肿瘤细胞永生化过程中起至关重要的作用。 胰腺癌的端粒酶活性检测，国内外报道较少［6］。本研究显示，端粒酶在胰腺癌组织中的表达阳性率显著高于胰腺良性病变，P16、RB基因表达蛋白阳性率显著低于胰腺良性病变，提示端粒酶激活、P16、RB表达蛋白的缺失，在胰腺癌的发生中起重要作用，是良好的肿瘤标记物。PCNA在胰腺癌中表达明显增多，分布呈异质性，提示胰腺癌细胞生长调节失控,DNA合成紊乱，反应出肿瘤增殖细胞群中并非所有细胞均同步增殖。在胰腺癌组织中端粒酶阳性、P16、RB表达缺失，其PCNA表达明显增多。这说明端粒酶激活、P16、RB表达缺失是促进细胞增殖重要因素之一。 P16、RB蛋白是一类负性细胞周期的调控蛋白，相关分析证实P16与RB表达间存在显著负相关性。同时，这一结果也证实了P16、RB基因表达蛋白调控胰腺细胞癌变的机理是一个负反馈环路。在此反馈环内，P16、RB表达蛋白任何之一表达缺失，都将导致调节环路的中断，造成细胞的异常增殖，最终导致胰腺癌的发生。 调控细胞永生化的端粒酶和P16蛋白在胰腺癌中的表达呈显著的负相关性，提示P16蛋白表达缺失结合端粒酶激活，可能在胰腺癌的发生上起着十分重要作用，与肿瘤发生的端粒端粒酶假说相吻合。Tresnasari等［7］在研究淋巴瘤形成中提出，P16/RB通路失活或P16表达下调结合端粒酶活性增强是导致淋巴瘤形成的致癌理论。在本研究中，P16/RB失活组端粒酶表达阳性率显著高于P16阳性/RB阳性组。这说明P16/RB通路失活和端粒酶激活是原发性胰腺癌发生中的重要组成因素。 本研究显示，P16表达缺失的患者临床分期较晚，更易发生淋巴结转移。这提示P16表达缺失，不仅在胰腺实体瘤的形成过程中起重要作用，而且对周围脏器的浸润和淋巴结转移可能也起着十分重要的作用。PCNA作为原位检测肿瘤细胞增殖活性的指标，其表达与肿瘤的分化、浸润、转移均有密切相关性，可作为肿瘤鉴别诊断和预后的参考指标。【参考文献】［1］ Sampedro Camarena F, Cano Serral G, Sampedro Santalo F. 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