5氟尿嘧啶磁性微球的制备及对人胰腺癌细胞的抑制作用

5氟尿嘧啶磁性微球的制备及对人胰腺癌细胞的抑制作用作者：孙诚谊 喻超 刘建刚 王玉芝 钱志勇　    作者单位：550001 贵阳医学院附属医院肝胆外科［孙诚谊(Email：chengyisun@medmail.com.cn)、喻超、刘建刚］； 100850 北京军事医学科学院放射医学研究所(王玉芝、钱志勇)     【摘要】  目的 研究5氟尿嘧啶磁性白蛋白微球(5fluorouracil magnetic albumin microspheres，5FUMAMS)的制备及其联合恒定外磁场体外对人胰腺癌PC3细胞的生长抑制作用。方法 乳化热固化技术制备5FUMAMS并检测其理化性质，MTT比色分析法观察5FUMAMS联合恒定磁场体外对人胰腺癌细胞的抑制作用。结果 5FUMAMS平均粒径为200～1000 nm，呈球形，磁响应性良好，载药量为每毫克微球含5FU 50μg；单纯磁场组和各种浓度的空白MAMS对肿瘤生长无影响；相应药物浓度的5FUMAMS与5FU抑制率(inhibition ratio，IR)相似，差异无统计学意义(P>0.05)；相应药物浓度的5FUMAMS联合恒定外磁场与单纯的5FUMAMS和游离5FU相比，IR明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论MAMS可作为安全的药物载体；5FUMAMS制备方法和剂型的改变不影响5FU的抗癌活性；联合恒定外磁场5FUMAMS的肿瘤细胞抑制效应显著增强。     【关键词】  5氟尿嘧啶磁性白蛋白微球； 恒定磁场； 胰腺癌PC3细胞     Preparation of 5fluorouracil magnetic albumin microspheres and its inhibitive action on human pancreatic carcinoma cells  SUN Chengyi*, YU Chao, LIU Jiangang, WANG Yuzhi, QIAN Zhiyong.*Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550001, China    【Abstract】  Objective  To prepare 5fluorouracil magnetic albumin microspheres (5FUMAMS) and discuss its inhibitive action combined with constant external magnetic fields on human pancreatic carcinoma PC3 cells in vitro. Methods  5FUMAMS was prepared by emulsionheat stabilization technique and their physicochemical property detected. The inhibition rates (IR) of 5FUMAMS combined with constant external magnetic fields were assayed by using MTT assay.Results  The mean diameter of 5FUMAMS was 2001000 nm, with round shape, good magnetic response and 5FU loading of 5%. The tumor growth showed no difference on tumor cells in both pure magnet group and MAMS group. The IR of 5FUMAMS and 5FU at same drug concentration was similar, with insignificant statistical difference (P>0.05). Compared with pure 5FUMAMS and free 5FU, IR was significantly increased after 5FUMAMS was combined with constant external magnetic fields (P<0.05). Conclusions  MAMS is a safe drug carrier. The preparation method and changes of dosage form exert no action on anticancer activity of 5FU. The inhibitive action is significantly enhanced after 5FUMAMS is combined with constant external magnetic fields.    【Key words】  5fluorouracil magnetic albumin microspheres;  Constant magnetic fields;  Pancreatic carcinoma PC3 cells    胰腺癌早期诊断困难，具有病程短、进展快、病死率高的特点， 中位生存期约6个月， 总体5年生存率低于5%［1］。目前对胰腺癌仍采用手术切除联合化疗的综合治疗方案。近年来，运用抗癌药物磁性纳米微球联合磁场治疗肿瘤取得可喜进展。本实验制备5氟尿嘧啶磁性白蛋白微球(5fluorouracil magnetic albumin microspheres， 5FUMAMS)并检测其理化性质，分析其联合恒定磁场对人胰腺癌PC3细胞的生长抑制作用，探讨联合磁场后5FUMAMS抑瘤作用增强的机制。1  材料与方法    1.1  材料    5FU，纯度99%，购自比利时Acros公司；牛血清白蛋白购自美国Sigma公司；超声乳化仪购自江苏金坛医疗仪器厂；SSX550型扫描电子显微镜购自日本；752型紫外可见分光光度计、Multiskan MK3型酶标仪购自上海分析仪器总厂；恒定磁场由北京新海空科技开发中心设计提供；胰腺癌PC3细胞系由解放军302医院肝胆研究中心赠送。    1.2  方法    1.2.1  5FUMAMS的制备：采用乳化热固化技术，取牛血清白蛋白250 mg溶于10 g/L 5FU蒸馏水溶液中，添加磁流体0.2 ml，再与100 ml含10%司盘80的蓖麻油混合，搅拌10 min，再超声乳化。另取蓖麻油100 ml加热至160 ℃，在搅拌下加入上述乳浊液，160 ℃保温10 min，然后搅拌6 h。加乙醚200 ml脱脂，离心，弃去油相，沉淀依次用乙醚，乙醇漂洗，最后置换在蒸馏水中，冷冻干燥48 h，即成微球粉末。    1.2.2  5FUMAMS磁响应：将5FUMAMS按浓度比为1∶10加入0.1%吐温80生理盐水中，超声分散，倒置显微镜下观察微球分散情况；同时，取混悬液1滴滴于载玻片上，然后将1块表面强度为3000高斯的铷铁硼磁铁置于载玻片一端，镜下观察微球运动及聚集情况。    1.2.3  5FUMAMS的形态与大小：将经超声分散的5FUMAMS悬液滴于玻片上，空气干燥后真空喷镀胶体金，扫描电镜下观察。    1.2.4  5FUMAMS的5FU含量测定：首先绘制5FU标准曲线，再测定微球中5FU的含量。精密称取5FU 20.5 mg溶于1 mol/L NaOH中，加蒸馏水定容到100 ml，配制成205 mg/L 5FU储备液。精密移取5FU储备液0、25、50、100、200、400、600、800、1000 μl于10 ml容量瓶中，0.1 mol/L HCl定容到10 ml。药物浓度为0、0.512 5、1.025、2.05、4.10、8.20、12.30、16.40、20.50 mg/L紫外分光光度计测定不同浓度药物的吸光度，将数据进行线性拟合，求出5FU的标准曲线方程为A＝0.007 32＋0.055 08C(相关系数0.999 95)。微球中5FU含量测定采用碱消化法，精密称取5FUMAMS和MAMS各10 mg，分别置于10 ml离心管内，加入5 ml 1 mol/L NaOH溶液。沸水浴水解2 h，冷却，用0.1 mol/L HCl定容到5 ml，在磁场强度为4000高斯的磁场下，进行磁分离4 h。分别取上清液0.5 ml，置于10 ml容量瓶中，0.1 mol/L HCl定容。以MAMS的上清液为对照，紫外分光光度计256 nm处测其吸光度。上述过程重复3次。带入标准曲线方程，求微球的载药量。    1.2.5  肿瘤细胞生长抑制实验：实验分5组。A组：5FUMAMS联合磁场组；B组：5FUMAMS组；C组：游离5FU组；D组：MAMS组；E组：单纯磁场组。参照5FU血浆峰浓度10.0 mg/L， 每组设含5FU浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L 7种不同的药物和微球备用。参照文献［2］采用MTT法测定肿瘤细胞生长抑制率(inhibition ratio，IR)。    IR=［(对照组OD值-空白调零孔OD值)-(实验组OD值-空白调零孔OD值)/(对照组OD值-空白调零孔OD值)。IR>50%时表示该药物敏感。    1.2.6  实验观察：培养过程中，倒置显微镜下观察各组肿瘤细胞形态学变化。    1.3  统计学分析    采用SPSS 10.0软件包进行统计学处理，数据以±s表示，组间差异进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  5FUMAMS的理化性质检测    扫描电镜照片显示：5FUMAMS平均粒径为200～1000 nm，大小均匀，呈球形，分散性较好，见图1。光学显微镜下，5FUMAMS分散性，粒度分布较好，表面光滑，外加磁场后，微球排列呈束状，向磁场端游走，随磁场强度的加大微球的游走速度加快，最后聚集于一侧，见图2。药物浓度(mg/L)组别1.02.05.010.020.050.0100.0A组9.6±1.525.0±1.942.3±2.560.0±2.772.4±3.180.1±3.687.2±4.2B组3.8±1.1a8.3±1.2a26.3±2.0a40.4±2.3a57.7±2.5a64.1±2.2a74.4±3.5aC组4.5±1.4ab10.3±1.6ab27.6±2.2ab41.7±2.4ab59.6±2.7ab65.4±1.9ab75.0±3.2ab a：P<0.05，与A组比较；b：P>0.05，与B组比较    2.2  胰腺癌PC3细胞生长抑制率的检测    2.2.1  实验观察：培养24 h后，显微镜下见各组肿瘤细胞完全贴壁，生长良好，折光性好。当加入药物培养72 h后，D组细胞和对照组细胞贴满孔底，生长良好，形态正常，折光性好；其他组细胞形态及数量差异大：B组和C组随着药物浓度的增高，贴壁细胞数量变少，悬浮死细胞增多，形态异常，折光性差；A组随着药物浓度的增高，贴壁细胞数量明显变少，单个或融和成团生长，悬浮死细胞很多，形态极不规则，折光性很差。    2.2.2  各种药物浓度对细胞的抑制作用：(1)D组不含化疗药物，E组为单纯磁场组，对肿瘤细胞均没有抑制作用。(2)从A、B、C组可知，IR随着药物浓度的加大而增强。(3)在5FU浓度为20.0 mg/L时，B组和C组的IR分别为57.7%和59.6%，IR>50%，药物敏感。两组在相应浓度下的IR相似，差异无统计学意义(P>0.05)。(4)在含5FU浓度为10.0 mg/L时，IR为60%，IR>50%，药物敏感，IR与其他两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。3  讨论    目前，磁靶向载药微球多处于实验阶段。有研究表明，应用磁性微球能使有效药物的化疗指数提高10～100倍［3］，其原因可能是：(1)磁性药物微球有缓释作用，可以相应的耐受较高的药物剂量。(2)合适的磁场强度和梯度下，磁性微球大量聚集使血流减缓，从而提高了颗粒的滞留，有可能使更多的载体发生血管外渗出，微球则起到了血管外药物贮存站的作用。(3)更多的磁性微球制剂从肿瘤组织的血管内皮中渗出，释放药物，使其在细胞或亚细胞水平发挥药理作用。(4)磁性药物微球在正常组织中的浓度大大减少，减少了对正常组织细胞的损伤［4］。但磁靶向治疗肿瘤的研究热点一直局限于网状内皮系统丰富且位置相对表浅易于加磁场的肿瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌等离体表较近的肿瘤。据笔者检索，至今尚未见国内外有将其应用于胰腺肿瘤的研究报道，其主要原因可能是由于：(1)磁靶向载药微球因容易被巨噬细胞吞噬，被动靶向于富含巨噬细胞的器官如肝、脾，相对而言胰腺因缺乏巨噬吞噬系统，故缺乏被动靶向功能。(2)胰腺位置深，很难选择合适的实验动物，常用的实验动物鼠、兔胰腺体积较小且不集中，分散存在，且体内外均难以施加磁场实现磁靶向治疗等原因阻碍了磁靶向载药微球应用于治疗胰腺癌的研究。    从本实验结果可知，单纯白蛋白微球和磁场体外对胰腺癌PC3细胞生长无影响，白蛋白微球可以作为肿瘤化疗药5FU的安全载体，载药MAMS和5FU有相似的抑瘤效应；5FUMAMS联合磁场能明显提高化疗药物的抑瘤效果。其机理可能是由于磁场对细胞膜有穿透作用，肿瘤细胞在磁场作用下，膜表面的带电离子由于受到洛仑兹力影响，其运动轨迹被约束，导致了肿瘤细胞膜上的电子和离子不能正常运动和传递，引起了肿瘤细胞膜微观结构的变化，从而影响了细胞膜的通透性和有序性 ［5］。这就为化疗药物分子更快、更多穿透细胞膜提供了条件，这可能是磁场与磁性化疗药物协同作用提高其抑制肿瘤细胞生长作用的原因之一。【参考文献】［1］ Yamaue H, Tani M, Onishi H, et al. Locoregional chemotherapy for patients with pancreatic cancer intrarterial adjuvant chemotherapy after pancreatectomy with portal vein resection. Pancreas,2002,25(4):366-372.［2］ Hfeli UO, Pauer GJ. In vitro and in vivo toxicity of magnetic microspheres. Journal of Magnetism and Magnetic Materials,1999,194(1):76-82.［3］ Alexiou C, Arnold W, Klein RJ, et al. Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting. Cancer Res,2000,60(23):6641-6648.［4］ Lubbe AS, Alexiou C, Bergemann C. Clinnical applications of magnetic targeting. J Surg Res,2001,95(5):200-206.［5］ 张静，孙润广，齐浩，等.脂肪酸甲胺铂配合物的结构表征及磁场对其抗癌活性的影响.化学学报，2000，58(6)：704-712.