腺相关病毒载体转染供肝方法学的实验研究

腺相关病毒载体转染供肝方法学的实验研究作者：邰升 苏志雷 王志兵 方泰石 商文刚 吴德全 韩德恩    作者单位：150086 哈尔滨医科大学第二附属医院肝胆外科    【摘要】  目的 探讨腺相关病毒载体基因转染的有效途径和方法。方法 我们设计肝动脉、门静脉、双重灌注3种途径和传统、循环、夹闭3种转染方法。通过观察肝脏灌注后颜色、检测肝脏功能和肝细胞转染率，确定灌注途径和转染方法，并探讨其安全性。结果 肝脏灌注后颜色无明显差别，无肿胀或花斑出现，血流开放以后肝脏颜色迅速恢复正常，3种灌注途径ALT比较差异无统计学意义（F=0.343，1.265，0.055，P＞0.05）；1周后肝脏组织均有免疫荧光染色，并且携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体，转染率比较差异无统计学意义（F=0.080，0.091，0.045，P＞0.05）。传统法的转染率略低于循环法，而夹闭法的转染率在各时间段均高于前两种方法，差异有统计学意义（F=3.880，2.976，5.129，P＜0.05）。3种方法转染率随时间逐渐升高，6周左右达到高峰，以后缓慢下降。结论 经肝动脉灌注是基因转染的有效途径，夹闭法可以提高目的基因的转染率，两者均无肝脏功能损害，腺相关病毒载体的转染呈缓慢、持续的过程。    【关键词】  腺相关病毒载体； 转染　　Methodology of transfecting gene into liver graft mediated by adeno-associated virus vector TAI Sheng, SU Zhi-lei, WANG Zhi-bing, FANG Tai-shi, SHANG Wen-gang, WU De-quan, HAN De-en.Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, China   【Abstract】  Objective  To investigate the effective route and proper method in transfecting gene into liver graft mediated by adeno-associated virus vector. Methods  Three routes including hepatic artery, portal vein and hepatic artery+portal vein, and 3 methods, i.e. routine, circulation and clamping were employed for infusion. The best infusion route and method of gene transfection into liver graft were determined by observing the color change of liver and detecting liver function and transfection rate of liver cells. The safety of these methods was evaluated. Results  In all the infusion procedures, the color of the liver grafts turned from red to white, no apparent color difference of the livers and no enlargement nor mottling were observed under surgical microscope. The liver color was back to normal immediately after blood flow was restored. No significantly statistical differences of the ALT values were observed among all the groups （F=0.343, 1.265, 0.055, P>0.05）. Adeno-associated virus vectors coding for the enhanced green fluorescence protein （AAV2-EGFP） were successfully transfected into liver cells by the 3 infusion routes 1 week later, and the differences of transfection rates via the 3 routes had no statistical significance （F=0.080, 0.091, 0.045, P>0.05）. The transfection rate of AAV2-EGFP was the highest at any time points when using the clamping method, and then followed by circulation method and routine method, with statistical difference （F=3.880, 2.976, 5.129, P<0.05）. The transfection rates of AAV2-EGFP were increased progressively and peaked at the 6th week, and then they were decreased gradually. Conclusions  Infusion via hepatic artery is the effective route for gene transfection and clamping the vessels can elevate the transfection rate of AAV2-EGFP. All procedures were performed without detectable liver injury. The transfection of gene into liver graft mediated by adeno-associated virus vector is a slow and persistent process.    【Key words】 Adeno-associated virus vector;  Transfection    免疫排斥反应仍是临床器官移植中面临的难题。通过基因治疗的手段来诱导供者特异性免疫耐受是当前研究的热点。大多数先前的研究报道，载体多经过门静脉灌注。我们尝试应用一种全新的夹闭转染技术，观察该方法的有效性和安全性，为大动物实验和临床应用奠定基础。1  材料与方法　　1.1  实验动物    成年雄性Wistar大鼠，体质量200～250 g，由哈尔滨医科大学第二临床医学院动物中心提供。术前晚禁食但不禁水。分为3种灌注途径，每种3只；3种转染方法，每种5只。　　1.2  载体    携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体AAV2-EGFP（5.0×1011病毒滴度）由北京本元正阳基因技术有限公司协助制备。　　1.3  载体灌注方法及转染方法　　1.3.1  灌注途径：（1）门静脉灌注：阻断肝固有动脉，用微血管夹于右肾静脉和脾静脉水平以上阻断肝下下腔静脉和门静脉。于远端结扎幽门静脉。在无肝期，用PE-10套管针穿刺幽门静脉并固定，以20 cm H2O（1 cm H2O= 0.098 kPa）的压力向肝脏匀速注入2～4 ℃的林格氏液2 ml以驱除肝脏内的血液，用无创微血管夹阻断肝上下腔静脉，然后切开保留线处左侧的膈静脉放出灌洗液，以20 cm H2O的压力、1.5 ml/min持续灌洗含AAV2-EGFP的林格氏液20 min。（2）肝动脉灌注：阻断肝固有动脉及胃十二指肠动脉远端，用微血管夹分别于右肾静脉和脾静脉水平以上阻断肝下下腔静脉和门静脉。于远端结扎幽门静脉。在无肝期，用PE-10套管针穿刺胃十二指肠动脉并固定，以120 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）的压力向肝脏匀速注入2～4 ℃林格氏液2 ml以驱除肝脏内的血液，用无创微血管夹阻断肝上下腔静脉，然后切开保留线处左侧的膈静脉放出灌洗液，以120 mm Hg、1.5 ml/min持续灌洗含AAV2-EGFP的林格氏液20 min。（3）门静脉、肝动脉双重灌注：同时置管灌注肝动脉和门静脉。　　1.3.2  转染方法：均采用肝动脉灌注的方法，以120 mm Hg的压力向肝脏匀速注入2～4 ℃的林格氏液2 ml以驱除肝脏内的血液后，用无创微血管夹阻断肝上下腔静脉。（1）传统法：然后切开保留线处左侧的膈静脉放出灌洗液，以120 mm Hg、1.5 ml/min持续灌洗含AAV2-EGFP的林格氏液20 min。（2）循环法：同时阻断肝下下腔静脉、门静脉，肝动脉和肝下下腔静脉在体外与一微量输液泵相连，以120 mm Hg、1.5 ml/min循环灌洗含AAV2-EGFP的林格氏液20 min（图1）。（3）夹闭法：同时阻断左侧的膈静脉和门静脉，以120 mm Hg、1.5 ml/min向肝脏灌洗含AAV2-EGFP的林格氏液2 ml，夹闭胃十二指肠动脉20 min后，结扎胃十二指肠动脉，按次序打开肝上、下下腔静脉，肝动脉，门静脉（图2）。　　1.4  指标检测　　1.4.1  血清ALT的检测：术后2、7、21 d尾静脉取血0.6 ml，37 ℃水浴15 min，2500 r/min离心10 min后取血清，置于4 ℃冰箱冷藏，应用自动生化分析仪测定ALT。　　1.4.2  肝脏组织绿色荧光蛋白转染率测定：术后2、4、8周分别行肝组织活检，取1 cm×1 cm×1 cm的肝组织2块，1块立即行连续冷冻切片，切片厚8 μm，共10张，在5个视野下通过免疫荧光显微镜观察，有绿色荧光的肝细胞即为被转染细胞，进行平均计数，取10张切片的平均转染率作为每一只大鼠的转染率。转染率（%）=（表达绿色荧光的细胞数/细胞总数）×100%。　　1.5  统计学分析    采用SAS软件进行分析，结果以x±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  3种灌注途径的情况    3种灌注途径大鼠全部存活。肝动脉、门静脉和双重灌注3种途径的比较结果见表1。1周后我们发现肝脏组织均免疫荧光染色，并且AAV2-EGFP转染率无明显差别。在灌注过程中，显微镜下可见肝脏由红润变为灰白色，肝脏灌注后颜色无明显差别，无肿胀或花斑出现，血流开放以后肝脏颜色迅速恢复正常，3种灌注途径ALT比较差异无统计学意义（F=0.343，1.265，0.055，P＞0.05）。肝动脉、门静脉和双重灌注3种途径的转染率比较差异无统计学意义（F=0.008，0.091，0.045，P＞0.05），术后6周转染率达到高峰（表2）。因此可选任何一种灌注途径，我们选择肝动脉灌注途径在实验中研究转染方法。表1  3种灌注途径大鼠ALT比较（略）表2  3种灌注途径转染率的比较（略）　　2.2  3种转染方法的情况    循环法大鼠死亡1只。传统、循环和夹闭3种转染方法比较结果见表3。在灌注过程中，显微镜下可见肝脏由红润变为灰白色，夹闭法肝脏略显灰暗，但无肿胀或花斑出现，血流开放以后肝脏颜色迅速恢复正常，其余2种转染方法肝脏灌注后颜色无明显差别。夹闭法ALT术后2 d略高于其余2种方法，但差异无统计学意义（F=0.233，0.390，0.033，P＞0.05）。传统法的转染率略低于循环法，而夹闭法的转染率在各时间段均高与前两种方法，差异有统计学意义（F=3.880，2.976，5.129，P<0.05）。3种方法转染率随时间逐渐升高，6周左右达到高峰，以后缓慢下降（表4）。表3  3种转染方法大鼠ALT比较（略）表4  3种转染方法转染率的比较（略）3  讨论    腺相关病毒载体目前是肝脏基因治疗的主要载体。最近的研究表明这类载体转染肝脏后可以耐受外来抗原的攻击。目前许多研究立足于延长载体转染肝脏的表达时间［1-2］。最近有报道在类人猿肌肉注射基因治疗后发生自体免疫性贫血［3］。在肝脏基因治疗的载体，应用对肝脏特异的启动子是获得有效基因转染而不诱发免疫反应的一个理想途径［4］。我们的目的就是最大效率地发挥转基因产物的表达水平和生物学活性，针对治疗目的个体化地应用转染时间和转染方法。我们的实验证实改进的转染方法和途径可以有效提高转染率。    实验证实肝动脉和门静脉是有效的基因转染途径，而且对肝脏组织的灌注同样有效。在临床，门静脉灌注需要彩超或CT下经肝脏门静脉置管术，这一过程容易造成腹腔内的出血，因为肝脏血流丰富。如果是血友病患者，这一方法更是禁忌证。而经肝动脉灌注可以通过股动脉这一常规途径完成，并发症和出血几率大大减少，而且可操作性和重复性均比较好。我们的实验证明经肝动脉和门静脉灌注肝脏的转染率无明显差别。这两种灌注途径不会对肝脏造成损伤，肝脏的颜色、质地和功能均无明显变化。我们通过肝动脉置管并且采用微量输液泵持续灌注，可以获得良好的结果。    从结果中可发现腺相关病毒的表达在术后6周左右达到高峰，8周仍有表达。这提示腺相关病毒的表达呈现缓慢、持续的过程。而我们设计的夹闭法和循环法可以在移植前对供者器官预处理，使排斥反应的时间与目的基因表达的峰时间相吻合，能最大效能发挥基因治疗的作用。夹闭法可以提高腺相关病毒的有效接触时间和浓度，而且不造成肝脏的毒性和损害。实验证明这一方法完全可以在肝脏离体后完成，使腺相关病毒与肝细胞表面特异性受体结合的数量增加而且结合更加牢固，从而提高转染率。另外夹闭技术弥补了注射后病毒载体很快被循环血液所稀释及补体清除的不足，而且腺相关病毒具有嗜肝性，能与肝表面特异性受体结合，很少感染其他细胞或肝外组织，不易激发机体针对病毒的免疫反应。免疫原性降低，可在不影响其他器官组织的情况下导致高特异性器官和组织转染，大大延长了目的基因的表达时间。夹闭灌注模型，实验方法简单，临床可操作性强，对大鼠的生理内环境无重大影响，是移植前基因治疗和预处理的合理、有效手段，适合未来临床应用。【参考文献】　［1］Mingozzi F, Liu YL, Dobrzynski E, et al. Induction of immune tolerance to coagulation factor Ⅸ antigen by in vivo hepatic gene transfer. J Clin Invest,2003,111（9）:1347-1356.　［2］Nathwani AC, Davidoff AM, Hanawa H, et al. Sustained high-level expression of human factor Ⅸ （hFⅨ） after liver-targeted delivery of recombinant adeno-associated virus encoding the hFⅨ gene in rhesus macaques. Blood,2002,100（5）:1662-1669.　［3］Chenuaud P, Larcher T, Rabinowitz JE, et al. Autoimmune anemia in Macaques following erythropoietin gene therapy. Blood,2004,103（9）:3303-3304.［4］ Follenzi A, Battaglia M, Lombardo A, et al. Targeting lentiviral vector expression to hepatocytes limits transgene-specific immune response and establishes long-term expression of human antihemophilic factor Ⅸ in mice. Blood,2004,103（10）:3700-3709.