NLRs家族成员NLRC5在免疫反应方面的研究进展

　　真核生物具有复杂的免疫识别系统,对病原体的识别主要通过病原相关分子模式(pathogen~associatedm°lecularpatterns,PAMPs)的受体介导,目前将这些受体称为模式识别受体(patternrecognitionrcceptor,PRR)[1]。　　在固有免疫反应中,正是PRR通过对PAMPs的识别来抵抗微生物对机体的人侵提供第一道防线。在PAMPs刺激后,这些PRR会引起核转录因子κB、I型干扰素(IFN-I)以及炎性体信号路径的激活,从而引起前炎性因子、抗病毒细胞因子的产生,最终诱导适应性免疫反应来抵抗病原体的产生[4]。　　这些PRR主要包括Toll样受体、NOD样受体(NLRs)、RI'R和MDA5及C型凝集素家族囵。研究发现,NLRs是细胞内PRR中一个很大的蛋白家族,它由保守的核苷酸结合寡聚域、富含亮氨酸重复序列以及易变的氨基端效应区组成,参与不同信号路径的激活。　　目前,人类基因组编码的NLRs成员有22种,而在鼠科中,最近的基因复制使NLRs家族成员增长到34种[5]。NLRs参与许多固有免疫反应信号路径,从调控蛋白激酶,NOD1、NOD2对NF钅B信号路径的调控[7],MHGⅡ基因对CⅡTA的过度调控到NI'Rs家族成员NLRP1、NLRP3以及NI'RC4对所谓炎症的半胱天冬酶1激活蛋白复合体的招募[HO]。目前,大量研究人员开始着手研究NLRs中成员之一NLRC5,现将近期关于NLRC5的结构、表达、免疫作用以及信号路径的研究总结如下。　　1NLRC5的结构RC5又名NOD27或ELJ21709或CLR16,1,人类NLRC5基因位于基因组16q13,横跨大约94kbp区域,该mRNA全长由6822对碱基对组成,共49个外显子编码,其翻译的蛋白由1866个氨基酸组成,因此NLRC5是NLRs家族成员中最大的蛋白,NLRC5的相对分子质量约⒛4000E+l。　　但有文献报道NLRC5横跨0~96kbp区域,该基因包括39个外显子,从第3个外显子开始翻译。该基因结构在脊椎动沥中是相当保守的,在哺乳动物进化的早期阶段可能是单基因复制。人类基因组编码的NI'Rs共同序列结构包括位居中心的腺苷酸三磷酸酶结构域、NACHT结构域以及羧基端的富含亮氨酸重复序列,其中NACHT结构域是介导寡聚化反应及蛋白质的激活[12]。　　除NLRX1和NAIP外,NI'Rs的氨基端部分是由死亡拆叠域组成[13],因此大部分NLRs家族成员要么有?个半胱天冬酶激活招募结构域(CARD),要么有一个热蛋白结构域(PYD),分别联系各自下游信号事件。　　NLRC5有典型的NLRs结构,但是还包含一个效应器区域,属于死亡折叠域,与NLRs家族的CAR1)或PYD没有明显的同源性,而且,NI'RC5的富含亮氨酸重复序列在所有NLRs家族成员中是最长的[1别。NLRC5的蛋白结构由CARD样区域、中心的NOD样区域和长亮氨酸重复序列区域三部分组成。CARD区域位于氨基端,横跨1~99个氨基酸;NACHT区域位于氨基酸220~383之间;而富含亮氨酸重复序列则位于羧基端,由剩余的713个氨基酸组成,这也展示了NLRC5与NLRs家族其他成员不同的结构。和所有在人类中发现的其他NLRs家族成员一样,NLRC5序列对比结果显示其具有与其他成员相同的整体区域结构,均由效应器、NACHT区域、翼螺旋、超螺旋以及富含亮氨酸重复序列区域组成。而不同之处在于NLRC5效应器区域类型不同以及具有显著的长亮氨酸重复序列。NLRC5的效应器区域由5条α螺旋线组成,显示出与CARD或PYD区域没有序列同源性,提示NI冫RC5的效应器区域在结构上类似于CARD和PYD,但具有不同界面的特征。NACHT区域具有共同的典型特征,为紧随其后的翼螺旋及超螺旋区域的水解发挥十分重要的作用。NLRC5的富含亮氨酸重复序列区域与N1~Rs家族的其他成员的不同之处在于它的长度超过10O0个残留物,在结构上应泫是形成整个循环,最后成为富含亮氨酸重复序列螺旋LhⅠ。　　2NL溆C5的表达的存在为了明确NI'RC5的生物学功能,通过快速扩增cDNA目的基因克隆了人和鼠Hl全κNl'RC5的cDNA,在其蛋白质中,二者的氨某酸序刭一致性占64%。　　人和鼠NI'RC5的mRNA在脾脏、胸腺以及肺中高表达。同时通过建立多克隆抗体抗内生型NLRC5实验证实NLRC5蛋白主要存在于人HEK293T细胞、人THP1细胞以及鼠RAW26⒈7巨噬细胞中[3]。　　然而,一些文献报道9NLRC5的mRNA表达普遍存在于各种不同器官中,在兔疫相关组织例如脾脏、淋巴结以及免疫细胞中存在最低转录水平。但大部分研究证实,包括骨髓、淋巴结、胸腺和脾脏,这些免疫组织是NI'RC5mRNA在人类以及鼠科动物中优先表达的资源。另外,NLRC5转录在一些器官的黏膜表面高度表达,例如肺、小肠、结肠和子宫。这些研究共同认为,NLRC5的mRNA及其蛋白主要在骨髓和淋巴结的主要细胞以及人THP1细胞、鼠科动物RAW264.7单核细胞系、T细胞和B细胞系、人宫颈癌细胞系中表达[14]。　　2.2NLRC5受刺激后引起的高表达分别用脂多糖、细胞内聚肌胞:聚胞嘧啶核苷酸EPoly(I:C)]以及口腔炎病毒增强的绿色荧光蛋白处理RAW264.7巨噬细胞6h后,R孓PCR及免疫印迹发现,脂多糖处理后NLRC5的mRNA及其蛋白表达明显上调,而后两者处理过的该细胞中NLRC5的mRNA仅有微弱的升高,其蛋白表达基本没有任何变化。为进一步明确NLRC5基因及蛋白表达上调的机制,在与上面实验条件相同情况下,用脂多糖处理野生型巨噬细胞及敲除MyD88的巨噬细胞[15],观察发现敲除MyD88的巨噬细胞中NLRC5的基因及蛋白表达无上调,从而提示NLRC5自身的表达是在MyD88-N,‘B路径控制下表达的,从而形成了一个负反馈循环[31。　　也有研究证实,NLRC5启动子能对IFNγ刺激等作出强烈反应。与之一致的是,在主要的免疫细胞,包括巨噬细胞、T细胞、B细胞以及各种各样的包括Hela细胞、THP1细胞、Caco2细胞、H孓29细胞在内的免疫和上皮细胞株中发现NI'RC5转录水平能被IFNγ高度诱导。双链RNA模拟物Poly(I:C)刺激Hela细胞、THR1细胞及人主要真皮纤维母细胞,或单链RNA仙台病毒感染这些细胞可以诱导NI'RC5的基因表达;但用Poly(I:C)或单链RNA口腔炎病毒感染RAW264,7巨噬细胞,NLRC5的基因表达不会增加。而用双链DNA巨细胞病毒感染人类包皮纤维母细胞后,NLRC5的基因表达显著上调;另外用JAK/STAT路径化学阻断剂或IFNγ中和抗体处理该类细胞后发现NLRC5基因表达上调消失,提示巨细胞病毒诱导的NLRC5基因表达上调涉及到IFNγ的自分泌,并且IFNγ受体介导JAK/STAT信号路径的激活[5]。STAT1是NLRC5诱导的关键因素。脂多糖诱导的NLRC5的表达依赖STAT1信号路径;而且,脂多糖处理过的Raw264.7细胞的上清液能够充分诱导kNI'RC5的表达。脂多糖调控的N,KB的激活会引起IFN=β的产生,后者反过来再通过STAT1信号路径诱导NI'RC5的表达。　　用NI'RC5C;FP复合物DNA转染293T细胞发现,NLRC5定位于细胞质,而不是细胞核或线粒体;当用脂多糖处理该细胞后其细胞定位无变化[3]。也有研究发现NLRC5和CⅡTA一样,包含一个细胞核定位信号,穿梭在细胞核与细胞质之间。在那些NLRC5蛋白高表达的细胞中NLRC5主要定位于细胞质,相反,在其蛋白较低表达的细胞中NI'RC5则主要定位于细胞核,提示NI'RC5的细胞核定位并不是超表达的结果。　　3NLRC5的作用　　3.1NLRC5对NRκB信号路径的影响NI'RC5本身的表达受N孓KB信号路径调控,于是形成一个负反馈循路。当脂多糖刺激某些NLRC5存在的细胞,NpκB信号路径激活后NI'RC5基囚及其蛋白会出现高表达。此时,由于NLRC5表达量高,且其相对分子质量大,能物理阻断NEMO与IKKα、IKKβ的结合,而NLRC5自身则与已被激活形式的IKKα、IKKβ相互作用,从而阻止IKKα、IKKβ去磷酸化IκBα以及IKK复合体,达到抑制NRκB信号路径的目的。无活性的NκB停留在细胞质中,与抑制蛋白家族中IkB家族成员相邻,即1κB家族成员为该信号路径的上游分子。　　由于NLRC5与IKKα、IKKβ发生作用致使抑制蛋白I钅B不能发生磷酸化,最终阻断了N,KB信号路径激活。综合之,NLRC5在受刺激的细胞中调控NFKB活化的关键在于NLRC5/IKKα/IKKβ与NEMO/IKKα/IKKβ复合体之间的动态平衡。这种动态平衡是由信号通路中的刺激和相关蛋白(NLRC5与NEMO)的浓度控制的,同时包括NI'RC5在脂多糖刺激后的信号放大通路中通过隔绝IKKα/IKKβ的活性来阻止IKK磷酸化作用及酶活性的能力来共同起作用[钊。　　3.2NLRC5对IFNI信号路径的影响IFNI　　信号传导途径的严格控制对有效的机体免疫反应至关重要,NLRC5是NOD样蛋白家族高度保守的成员,能抑制IKK复合体与RIGI/MDA5功能。RIGI和MDA5是激活IFNl信号传导路径的关键受体,受正、负调控器控制[19]。NLRc5通过结合胞内外源RNA受体RIGI与MDA5,但不结合MAVS受体,抑制RLR介导的IFNI免疫反应。　　就整条RIGI而言,NI'RC5更强有力地结合其CARD区域,进一步提示在病毒或其配体剌激后CARD区域会变得更易接近,而NLRC5能特异性地识别该区域。同时,特异性敲除siRNA的NLRC5能促进IFNI信号途径和抗病毒免疫系统。研究结果表明,NI'RC5作为一个负调控因子能阻断IFN-I信号传导途径中的2个中心组分,能够抑制这条信号传递的通路,同时表明NI冫RC5在天然免疫系统中起着重要作用L3]。　　然而,另一些文献则报道,在人纤维母细胞感染巨细胞病毒后,IF№γ发生自分泌,通过JAK/STAT信号路径引起NI'RC5的表达上调[到;使用JAK抑制剂则降低了IFNγ对NLRC5启动子活化的调控影响。而NI'RC5蛋白的超表达及寡聚化反应引起FN调控的启动子元件I「Nγ的激活,以及特定的IFN响应元件、抗病毒靶基因的表达上调。在感染巨细胞病毒情况下,敲除NI'RC5基因会显著地削弱I「Nα等目标基因的诱导。NLRC5是IFNγ激活序列的分子开关,是IFN介导的抗病毒信号路径的中介物[11]。　　与之一致的文献报道,NLRC5敲除的细胞在病毒感染后IFNβ的诱导表达较敲除之前明显降低11刽。而有文献则证实敲除NLRC5基囚后IFNβ及白介素的表达明显上调。　　3.3NI~RC5对MHGI基因的影响MHGI在把抗原呈递给CD8+T细胞的免疫防御抗病毒、抗肿瘤中起关键作用。MHGI基因表达的严格控制是CD8+T细胞活化以及适应性免疫应答的关键「21]。　　在活的有机体内,NI'RC5是宿主防御细胞内病原体的关键调节器E22I,同时也是MHGI基困的转录调控者。NI'Rc5能把MHt?基因邻近的激活子联合起来并反式激活这些激活子。　　NI'RC5介导的MHGI基因诱导需要W/S、X1、X2顺式调控元件。而转录因子RFX5、RFXAP和RFXANK/B共同组成RFX蛋白复合体,与X1组件共同参与其诱导过程。同时,NLRC5与RFX因子组件、CREB/ATF1家族转录因子共同组成特定的MHGI基因增强体,从而启动MHG1基因邻近的激活子W/SXY核组件,进而诱导MHGI基因表达。　　亦有文献证实,NLRC5是一个转录调控因子,能把MHGI路径中关键组件的表达协调结合起来。NLRC5能诱导β2一微球蛋白和多功能蛋白酶的表达,其中,β2ˉ微球蛋白是抗原提呈的运输者,而多功能蛋白酶则是MH⒍I抗原呈递所必需的。继之,NLRC5激活MHG1基因启动子,进而诱导MHCI基因表达∴引起相应免疫应答。　　在NLRC5缺失的鼠中,MHGI基因表达明显缺乏,其伴随物不能激活CD8+T细胞应答,而且,该类鼠更容易感染病原体。在不同的人类细胞系和主要的真皮纤维母细胞中敲除NLRC5亦会导致MHGI基因表达降低;在MH⒍I基因表达非常低的细胞中引入NLRC5会增强该基因的表达水平。　　3.4NLRC5在抗病毒等免疫方面的作用IFNγ在抗原或有丝分裂原刺激下由T细胞或自然杀伤细胞产生的一种细胞因子,有重要的抗病毒作用和免疫调控作用[26]。　　相关文献已经描述NI'RC5的超表达可以引起IFN的表达上调。NLRC5在巨细胞病毒诱导的免疫应答中有独立性的作用,说明NLRC5可能参与抗病毒反应。同时,NLRC5可能影响NOD2介导的抗病毒应答。　　在人单核细胞实验中已证实,RNA干扰介导的敲除的NLRC5几乎消除了半胱天冬酶1、II'-1β及I⒈18对细菌感染、PAMPs、危险相关分子模式的处理反应。NLRC5与蛋白酶原1、前IL-1β炎性体适配器ASC共同形成炎性体活动行为,该行为同时需要NLRP3协作,提示NLRC5与NLRP3相互作用共同激活炎性体,引起免疫反应[27]。　　但也有研究论证,NLRC5在HEK293T细胞中超表达很可能通过转录抑制作用全面抑制NFκB、AP1以及依赖IFNI信号路径的免疫应答.敲除RAW264.7鼠巨噬细胞中NLRC5基因会引起FNγ、脂多糖促炎反应的有效上调,其中包括肿瘤坏死因子、IL-6、IL-1β分泌增加以及细胞表面CD40表达增加。这种负调控免疫炎症反应说明NLRC5很可能是调控炎性疾病、自身免疫性疾病或败血症的免疫应答的靶目标。　　4展望虽然NLRC5的结构已经得到研究者们的一致意见,其启动子和基因产生可能受IFNγ、双链RNA病毒模拟物Poly(I:C)以及其他细胞因子、微生物组件调控,但是NLRC5在宿主防御和调控免疫信号路径方面的作用仍然存在争端。一些研究认为NLRC5的作用是积极的,一些则认为NLRC5是N,托B、IFN、AP1信号和抗病毒免疫的负调控子;也有研究提示NLRC5参与炎性体信号的调控。　　然而这些推定的NLRC5的角色在NLRC5缺失的细胞中,感染细菌、病毒等病原体或微生物受体刺激的鼠中并没有得到证实;而且,NI冫RC5调控MHCI转录也存在争议。因此,NI'RC5在调控免疫信号路径方面的确切作用目前仍然还不是很清楚,需要进一步实验研究来证实NLRC5是如何影响宿主抵抗病原体和产生免疫信号;同时NLRC5在抗肿瘤方面的研究目前尚未报道,有待进行相关实验研究证实其在肿瘤方面的免疫作用。　　参考文献　　Fritz 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