COPD小鼠肺组织中Th17细胞相关因子的表达规律

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是近年来对人类危害最大的呼吸系统疾病之一。研究发现气道变应性炎症是COPD发病的关键,是气道高反应性和气道重建的基础,气道炎症的持续存在是COPD发作、肺功能下降的主要原因。Th17细胞是近年来发现的一类介导机体炎症反应的重要细胞亚群。进一步的研究发现Th17细胞及其分泌的炎症介质可促进中性粒细胞及嗜酸性粒细胞在气道内聚集,加重气道炎症,可能与气道重塑密切相关。白细胞介素17(IL-17)是TH17分泌的主要效应因子,该因子在炎性反应、自身免疫性疾病中发挥着极其重要的作用。维甲酸相关核孤受体γt(RORγt)是调控Th17细胞分化的特异性转录因子,诱导初始T细胞向Th17细胞分化;信号转导和转录激活因子3(田队T3)是RORγt的一个重要活化信号,诱导ROR/的表达,启动T№细胞向Tll17细胞的分化。本研究在建立CC)PD小鼠模型的基础上,通过检测比较正常组与模型组小鼠肺组织中STAT3、RORγt和IL-17mRNA水平的变化情况以及血清中白细胞介素6(IL6)、白细胞介素10(IL-10)和IL-17的表达规律,探讨Th17细胞在参与COPD炎性机制中所起到的作用。

1材料与方法

1.1实验动物及CoPD模型建立清洁级,雄性昆明小鼠40只,6~8周龄,体质量18~20g,由新疆维吾尔自治区疾病控制中心提供。应用数字表法将动物随机分为正常组和COPD模型组,每组20只。模型组使用自制熏烟箱进行熏烟,1O支香烟/次,1日1次,每次1h,持续6个月。

1.2主要试剂Thzol(购置于invitrogelil公司,货号15596026);M-MLV First⒏rand Kit(购置于imitrogen公司,货号c28025030),荧光定量试剂盒Platinum SYBR Greem qPCR SuperMIX(购置于invitrogcn公司,货号d1744△00),Mousc IL-10Quantikinc EL-ISA Kit,2Platc(购置于R⒏D公司,货号M1000),M°uscL-17Quantikine EL-ISA Kit,2Plate(购置于R⒏D公司,货号M17OO),M°use IL6Quantikine EL-ISA Kit,2Plate(购置于R⒏D公司,货号M60O0B)。

1.3标本采集和处理两组小鼠最后一次处理24h后固定,将眼部皮肤往颈后拉,使眼球突出充血,用镊子迅速夹去眼球,同时将小鼠头向下,使血液滴人EP管内,37C静置30min,收集血清,-70C保存备用。将小鼠仰卧同定,打开胸腔,取右侧肺组织放人组织冻存管内并置于液氮中冻存备用。

1.4 HE染色取左侧肺组织4%多聚甲醛固定,酒精脱水,石蜡包埋,常规HE染色。

1.5血清中细胞因子的定量检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附(EL-ISA)法检测小鼠血清中L-6、IL-10和IL-17的含量,按试剂盒说明书操作规程进行检测,通过标准品吸光度值(A值)绘制标准曲线,然后计算各样本的值。

1.6 PCR引物的设计目的基因引物序列:IL17(PCR产物为165bp):上游引物:5′-TTTAACTC CCTTGGCGCAAAA3′,下游引物:5′CTTTC—CCTCCGCATTGACAC3’,退火温度为58C。RORγt(PCR产物为198bp):上游引物:5′—AGT GTAATGTGGCCTACT CCT3′,下游引物:5′-GCTGCTGTTGCAGTTGTTTCT3′,退火温度为57C。STAT3(PCR产物为210bp):上游引物:5′TGCCTTATCAGGGCTGGG A TAC3′下游引物:5′GGGACCTTTAGACACGCAAGGA3′,退火温度为57C。阡actin(PCR产物为205bp):上游引物:5′CGTTGACATCCGTAAAGA CC3′,下游引物:5′AACAGTCCGCCTAGAAGCAC3′,退火温度为58C。

1.7肺组织总RNA的提取及反转录将100mg肺组织于液氮中研磨,在液氮挥发完全前用DEPC处理过的不锈钢钥匙把粉状物转加人亏1mL-的Trizol裂解液中,并振荡混匀;然后样品置于离心机中4°C、12ooo r/min离心10min;将上清转移到处理过的新离心管,加入200uL氯仿震荡混匀,并于室温放置5min,使核酸和蛋白质充分分离;于4C、12ooo〃min离心15min;将80%左右的上清转移到新的离心管,然后依次加人250uL异丙醇及250uL5m。l/L的Nacl溶液,震荡混匀,室温放置8血n使RNA沉淀完全;于ΓC、12000〃min离心10min;弃去上清,然后加人1mL7o%的乙醇,混匀,4C、750o〃min离心5min,(此步骤重复2遍);弃去上清,室温干燥3min,然后溶于DEPC处理过的水中;并通过紫外/可见分光光度计(Nan。Drop ND2000Spectr°phot°meter)检测丿总RNA的浓度和纯度。RNA提取后加人DNA酶对基囚组进行消化。反转录使用TaKaRa公司的AMV反转录酶、dNTP Mixture、Oligo dT-Adaptor Primer,20L体系进行反应,反应条件为:42C60min,99·C5min,4C5血n。反应结束后,将反转录产物cDNA置于-70·C冰箱保存备用。

1.8 ReaI-Time PCR每组样品cDNA有3~6个重复,每个重复进行3个平行实验,按照invitrogm公司Platinum SYBR Green qPCR SuperMIX反应试剂盒的产品说明进行反应。将样品加入反应管中后放人RAD公司的G1000Thermal Cycler中进行检测,反应条件为:95C1os,95C5min,95·C3os,58°C30s,72·C30s,4O个循环。由于使用的是相对定量法即,所以必须对各个样品的扩增效率进行校正,具体方法为:将cDNA分别稀释10、102、103、101、1o5和106倍,使用R←al ome PCR分别扩增3种基因,并做标准曲线,得到斜率,利用公式:计算得到校正后各基因扩增效率。

1.9统计学处理所有统计数据用SPSS17.0统计软件处理,所得数据用均数±标准差(F±s)表示,统计方法为单因素方差分析,P(0,05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肺组织病理切片正常组支气管形态较为规则,没有纤维组织增生,管腔内极少见到炎症细胞极其分泌物,肺泡形态大小均匀,未见炎症细胞浸润(图1A)。C(DPD模型组有少量中性粒细胞及巨噬细胞浸润,肺泡腔形态不规则,壁薄、扩张,部分破裂融合形成肺大泡(图1B、C、D)

2.2小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-10与IL-17的表达规律采集正常组与CoPD模型组小鼠的外周血并分离血清,分别测定L-6、IL-—10和IL-17的含量,每只重复3次,结果表明模型组小鼠血清中IL17的含量为(23.37±3.57)pg/mL,明显高于正常组的表达水平(P<0,05);模型组L-6的含量为(13.34±3.02)pg/mL,明显高于正常组的表达水平(P<0。O5);模型组IL-10的表达量为(3,78±o.56pg/mL-,相对于对照组E(2,34±0,32)pg/mL彐明显增加(P<0.05),见表1。

2.3小鼠肺组织中Th17细胞相关因子转录水平的变化通过采集各组小鼠肺组织进行Th17细胞相关因子的检测发现,COPD模型组小鼠肺组织中IL-17mRNA水平较对照组明显升高(P(0.05),见图2A;作为调控Th17细胞分化的特异性转录因子的RORγt在模型组肺组织中的表达与对照组相比同样明显(P<0,05),见图2B;对照组小鼠肺组织中STAT3mRNA水平明显低于CoPD模型组(P(0,05),见图2C。

3讨论

Th17细胞是近年来发现的一种不同于Th1、Th2和Treg的T细胞亚群,其特点是不分泌IL4与IFNγ,但是高表达L-17。这类细胞自身具有独立的分化和发育调节机制,在慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病以及移植排斥反应中发挥重要的调节作用,并发现L-17的高表达可能促进肿瘤的浸润和转移,其分泌的炎症介质可能参与肺组织内的炎性变化,从而加重气道炎症,进一步导致气道重塑。IL-17是一种可溶性细胞囚子,其在T细胞诱导和促进炎症发生过程中起着极其重要的作用[12],并且作为Th17细胞分泌的重要细胞因子,其还可以同炎症因子TN,α等有协同作用,进一步加强其炎症反应L131返l,诱导一系列炎症因子IL6、急性反应蛋白、粒-巨细胞刺激因子(G CSF)和前列腺素E2等的表达[15]。IL-17可能从多个方面作用于气道炎症,如发现IL-17可能与气道中性粒细胞募集、活化有关,其机制可能是通过IL-17A上调靶上皮细胞趋化因子如IL8的表达,从而促进中性粒细胞和单核细胞的募集。Dragon等研究发现IL-17还可以诱导气道上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞产生炎症趋化因子及相关细胞囚子。RORγt是调控Th17细胞分化的特异性转录因子,其主要存在于CD4+、CD8+淋巴细胞内,并且受到STAT3的调控,在这一转导调控途径中RC)Rγt可以诱导初始T细胞向Th17细胞分化,从而分泌大量的H-17,加重炎性反应过程。而L-6与TGFβ同时存在的情况下可以大量诱导RORγt进行表达并随后产生H-17。本研究发现COPD模型组小鼠肺组织中IL-17 mRNA水平较对照组显著升高(P<0.05),并且血清中IL-17表达量的检测中得到了相同的结果(P<0.O5)。表明IL-17可能在COPD炎性进程中起着较为重要的作用。黎静等研究发现IL-10参与COPD患者气道炎症反应,可能与疾病的严重程度有关,而在本研究中模型组相对于对照组IL-10的增加,则可能表明在COPD的炎性进程中Th17细胞增加的同时存在制衡关系Treg细胞也有所增加,并通过分泌IL-10影响Th17细胞的分化。Schols等发现IL6参与了COPD患者的全身性炎症反应,是介导机体炎症反应的董要细胞因子。本研究中IL6及STAT3在COPD模型组中的表达显著高于对照组,这提示IL6/STAT3信号通路的高表达诱导刺激了RORγt的进一步激增,致使Th0细胞大量分化为Th17细胞,并分泌表达细胞炎性介质,从而增强了CoPD模型小鼠肺组织内的炎性变化。通过本研究发现Th17细胞可能在COPD气道炎症的发生发展中起着重要作用,介导肺部炎性反应,并可能对肺部炎症性疾病具有促进作用,但其具体作用机制还有待于进一步研究。

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