川芎嗪对支气管哮喘患者Tbet、GATA3及气道炎症的影响

　　作者：殷凯生,吉宁飞,何畏,解雨春,卞涛　　作者单位：210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院呼吸内科(殷凯生，卞涛);210024 江苏省南京市，江苏省老年医院干部保健科(吉宁飞，何畏);中心实验室(解雨春)

　　【摘要】目的观察川芎嗪对支气管哮喘患者气道炎症的作用以及对转录因子Tbet和GATA3表达的影响。 方法 60例哮喘患者随机分成常规治疗组(A组)和川芎嗪联合治疗组(B组)，每组30例。另外选取健康人30例做为正常对照组(C组)。观察治疗前后的临床疗效，采用ELISA法检测干扰素γ(IFNγ)和白介素4(IL4)水平，采用RTPCR法测定Tbet和GATA3的表达。 结果 治疗前A、B组的Tbet、IFNγ水平明显低于C组，GATA3、IL4水平明显高于C组(P<0.05)，A、B组间没有显著差异;与治疗前比较，治疗后A、B组的Tbet、IFNγ以及GATA3、IL4水平均有显著性差异(P<0.05);治疗后B组的Tbet和IFNγ水平均高于A组， GATA3和IL4水平均低于A组(P<0.05)。 结论 在常规哮喘治疗的基础上，加用川芎嗪可以取得更好的疗效。川芎嗪通过纠正哮喘患者的免疫失衡来治疗哮喘，为川芎嗪对哮喘的治疗进一步提供了理论依据。

　　【关键词】 支气管哮喘; 气道炎症; Tbet; GATA3; 川芎嗪

　　Effects of ligustrazine on airway inflammation and transcription factor Tbet and GATA3 expression in patients with bronchial asthma YIN Kaisheng, BIAN Tao.Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; JI Ningfei, HE Wei. Department of Cadre Health Care; XIE Yuchun. Centre Laboratory, Jiangsu Province Geriatric Hospital, Nanjing 210029,China

　　【Abstract】　Objective To observe the effects of ligustrazine on airway inflammation and transcription factor Tbet and GATA3 expression in elderly patients with asthma. Methods Sixty elderly patients with asthma were randomly divided into routine treatment group(group A) and ligustrazine group(group B). Thirty healthy subjects were chosen as normal group (group C). The concentrations of IL4 and interferonγ(IFNγ)were measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA). The expressions of Tbet and GATA3 were measured by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results Before treatment, the levels of Tbet and IFNγ were lower and the levels of GATA3 and IL4 were higher in group A and B than those in group C. There were no significant differences in the levels of Tbet, IFNγ, GATA3 and IL4 between group A and group B. After treatment, the levels of Tbet and IFNγ were significantly increased and the levels of GATA3 and IL4 were significantly decreased. There were significant differences in the levels of Tbet, IFNγ, GATA3 and IL4 between group A and group B after treatment. Conclusions The combination therapy of routine treatment and ligustrazine could get better efficacy in treating asthma.

　　【Key　words】 bronchial asthma; airway inflammation; Tbet; GATA3; ligustrazine 支气管哮喘(哮喘)发病机制复杂，Th1、Th2细胞亚群比例和功能的失衡，是免疫学哮喘发病的经典机制。Tbet、GATA3分别作为Th1、Th2特异性的转录因子，在Th1/Th2的极化中起重要作用。我们在前期研究中发现，川芎嗪可增加哮喘大鼠Tbet表达，抑制GATA3表达，从而影响Th1/Th2型细胞因子分泌，达到抑制气道炎症、降低气道高反应性的作用[12]。为了探讨川芎嗪是否能影响哮喘患者的Tbet、GATA3的表达以及Th细胞的分化，本研究检测了外周血单个核细胞(PBMC)来源的淋巴细胞中Tbet、GATA3的表达以及培养液中的干扰素γ(IFNγ)、白介素4(IL4)的水平，以探讨川芎嗪对哮喘的免疫作用机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 研究对象为2008年2月至2009年6月在门诊收治的哮喘患者，符合2008年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘防治指南诊断标准[3]。选择轻至重度急性发作期老年哮喘患者60例，同时选择健康人30例做为空白对照，均为无吸烟史、无过敏性疾病史的健康老人。受试者均无严重心、肝、肾疾患及恶性肿瘤等疾病，近4周内未使用糖皮质激素等免疫抑制剂或细胞毒药物，抽血前12 h 未服用支气管扩张剂。入选患者均知情同意。男36例，女24例，年龄65～78岁，平均(71.3±6.9)岁。

　　1.2 分组 将入选的60例哮喘患者随机分为2组，其中30例予糖皮质激素和β受体激动剂等，为常规治疗组(A组)，另外30例在常规治疗基础上联用川芎嗪治疗，为联合治疗组(80 mg/d，B组)，每日1次。连续10 d。30例健康老年人做为正常对照组(C组)。3组患者均在治疗前与治疗10 d后抽取静脉血检测PBMC来源的淋巴细胞中的Tbet、GATA3水平以及培养液中的IFNγ、IL4水平。

　　1.3 方法

　　1.3.1 临床疗效判断：显效：24 h咳喘明显减轻，两肺哮鸣音明显减少或消失;有效：24～72 h咳喘减轻，两肺哮鸣音减少;无效：72 h咳喘无减轻，两肺哮鸣音无改善或加重。

　　1.3.2 淋巴细胞的分离与体外孵育：取乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)抗凝静脉血2 ml，加入淋巴细胞分离液，1500 r/min离心5 min，收集上层淋巴细胞，氯化氨溶液冰浴破坏红细胞，锥虫蓝染色判定细胞活力>95%。用含10%小牛血清的RPMI1640培养液将细胞浓度调至1×106/ml。加入终浓度100 μg/ml的植物血凝素(PHA)，37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h，收集培养液，-20 ℃冻存待测。

　　1.3.3 Tbet及GATA3 mRNA表达水平检测：参照文献[2]进行淋巴细胞总RNA提取与定量，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Tbet、GATA3及β肌动蛋白(βactin)表达水平，其中Tbet上游引物为：5′GTGACCCAGATGATTGTGCT3′，下游引物为：5′GGTTGGGTAGGAGAGGAGAG3′，扩增长度为324bp;GATA3上游引物为：5′CGAGAAAGAGTGCCTCAAGTACC3′，下游引物为：5′GAAGTCCTCCAGTGAGTCATGC3′，扩增长度为619bp;βaction上游引物为：5′TGGGTCAGAAGGATTCCTAT3′，下游引物为：5′ATGAGGTAGTCAGTCAGGTCC3′，可扩增长度为259bp。采用图像分析软件进行Tbet及GATA3 mRNA表达水平的半定量测定，最后对RTPCR产物进行鉴定。

　　1.3.4 IFNγ及IL4测定：采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，按照检测试剂盒说明书操作，测定培养液中细胞因子IFNγ及IL4浓度。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS 11.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(±s) 表示，采用方差分析和q检验比较组间差异，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 临床疗效比较 B组的临床显效率和有效率均高于A组(P<0.05)，而临床无效率明显低于A组(P<0.05)，见表1。表1 治疗后2组患者临床疗效的比　注：与A组比较，*P<0.052.2 治疗前后Tbet、GATA3、IFNγ和IL4水平比较 C组治疗前后均无明显区别;治疗前A、B组的Tbet、IFNγ水平低于C组，GATA3、IL4水平高于C组，其差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前A组的Tbet、IFNγ以及GATA3、IL4水平均和B组相似。治疗后A组的Tbet、IFNγ以及GATA3、IL4水平均低于治疗前，其差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后B组的Tbet和IFNγ水平均高于治疗前， GATA3和IL4水平均低于治疗前，其差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后B组的Tbet和IFNγ水平均高于治疗后的A组， GATA3和IL4水平均低于治疗后的A组，其差异均有统计学意义(P<0.05)。表2 3组治疗前后Tbet、GATA3、IFNγ和IL4的水平比较注：与C组比较，*P<0.05;与治疗前比较，△P<0.05;与A组比较，#P<0.053 讨论

　　哮喘是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等多种炎性细胞和细胞组分共同参与的气道慢性炎症反应。其中CD4+ T细胞又称辅助性T细胞，即Th细胞。1986年Mosmann等发现小鼠CD4+ T细胞株按产生细胞因子的类型和生物学功能，可分为Th1和Th2两个亚群;1991年Maggi等发现，人类Th细胞存在Th1和Th2亚群。Th1主要分泌细胞因子IFNγ、IL2、IL12等，可激活巨噬细胞，对IgE合成无作用，在抗病毒感染和胞内细菌感染的免疫应答中发挥作用。Th2主要分泌细胞因子IL4、IL5、IL6、IL10、IL13等，参与急性超敏反应，对B细胞合成所有抗体包括IgE有辅助作用，在对过敏原和寄生虫感染的免疫反应中起作用。

　　转录因子是一类识别和结合特定DNA调节序列，并刺激或抑制转录的核蛋白，其数量或活性异常可导致对细胞生长和分化起关键作用的基因的异常表达[4]。促使Th1、Th2分化的转录因子很多，其中以Tbet和GATA3最为重要。Szabo等[5]指出，人类Tbet基因可能与哮喘基因相连锁。Tbet是Th1细胞分化特异性的转录因子，在Th1细胞的活化中起着核心作用，Tbet的另一个重要功能是将Th2细胞逆转为Th1细胞。在T细胞经体外培养诱导向Th2分化的过程中，导入Tbet基因，可以促使IFNγ的产生，而分泌IL4和IL5的细胞数量大幅度减少。Tbet抑制Th2的分化或再分化可能并非是对其IL4、IL5等细胞因子基因表达的直接抑制，可能是Tbet直接抑制GATA3基因，后者直接调控IL5的表达[6]。GATA3是一种锌指蛋白，是Th2细胞特异性的转录因子。1999年Nakamura等用原位杂交方法检测了10例正常人及10例哮喘患者肺泡灌洗液、支气管粘膜活检组织中GATA3基因表达情况，及其与气道过敏性炎症、IL5基因表达的关系，发现与正常人相比，哮喘患者气道内GATA3 mRNA的表达量明显升高，表达GATA3的细胞数量与气道高反应性及气道口径的减少程度密切相关。GATA3控制Th2活性通过诱导Th2细胞因子基因表达，并且诱导Th0细胞偏向Th2功能分化。研究显示，将GATA3逆转录病毒转入发展中的Th1细胞，不仅诱导产生Th2细胞因子，而且通过抑制IL12Rβ2链和IFNγ的表达造成Th1细胞反转为Th2表型[78]。

　　在前期对哮喘大鼠模型的研究中，我们发现地塞米松抑制GATA3 mRNA和蛋白的表达，对Tbet mRNA和蛋白的表达无明显影响;地塞米松干预后，哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液(BALF)中IFNγ蛋白含量无明显变化，IL4蛋白含量明显降低[910]。川芎嗪增加哮喘大鼠Tbet mRNA和蛋白的表达，同时抑制 GATA3 mRNA和蛋白的表达;川芎嗪干预后，哮喘大鼠血清和BALF中IFNγ蛋白含量增加，IL4蛋白含量则明显降低[12]。在本研究中，我们发现川芎嗪亦能够增加哮喘患者Tbet mRNA的表达，同时抑制 GATA3 mRNA的表达;川芎嗪干预后，哮喘患者外周血PBMC中IFNγ蛋白含量增加，IL4蛋白含量则明显降低。而常规治疗组抑制哮喘患者GATA3 mRNA表达，对Tbet mRNA表达无明显影响;予常规治疗后，哮喘患者外周血PBMC中IFNγ蛋白含量无明显变化，IL4蛋白含量明显降低。上述结果提示川芎嗪具有免疫调节作用，其可以通过调控哮喘患者Tbet和GATA3的平衡，调节Th1和Th2细胞亚群的平衡来抑制气道炎症;而糖皮质激素在哮喘发病的免疫机制中，可能仅作为免疫抑制剂而发挥作用。

　　本试验发现，在常规哮喘治疗的基础上，加用川芎嗪可以取得更好疗效。川芎嗪通过纠正哮喘患者的免疫失衡来治疗哮喘，为川芎嗪对哮喘的治疗进一步提供了理论依据。值得关注的是，目前尚缺少大规模人群中的Tbet和GATA3基因的筛查以及基因多态性的研究。当然，川芎嗪是通过哪些通路作用于转录因子Tbet和GATA3，还需要更加深入的研究。

　　【参考文献】

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　　[3] 中华医学会呼吸病分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案)[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31(3):177185.

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　　[7] Ouyang W, Lohning M, Gao Z, et al. Stat6independent GATA3 autoactivation directs IL4independent Th2 development and commitment[J]. Immunity, 2000, 12(1): 2737.

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　　[9] 吉宁飞，卞涛，殷凯生.地塞米松对哮喘大鼠转录因子GATA3表达的影响[J].南京医科大学学报：自然科学版，2006，26(9)：791794.

　　[10]吉宁飞，何畏，卞涛，等.地塞米松对哮喘大鼠Tbet、GATA3及气道炎症的作用机制[J].南京医科大学学报:自然科学版，2008，28(11)：14211432.