外周静脉给予PACAP38对脑缺血再灌注损伤的保护作用

　　作者：史秀丽,王传明,杨莹,傅佳　　作者单位：230022 合肥 安徽医科大学第一附属医院神经内科

　　【摘要】目的 探讨通过外周静脉途径给予垂体腺苷酸环化酶激活肽38(PACAP38)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 线栓法制作大鼠大脑中动脉梗阻模型，脑缺血2 h再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时分别外周静脉途径给予PACAP38，维持48 h后取出脑组织，测定脑梗死体积、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，并设立对照组，对照组静脉输入生理盐水。结果 PACAP38能显著减轻脑梗死体积，增加SOD活性，降低MDA和NO含量，再灌注后6 h时给予PACAP38上述改变最为明显。结论 PACAP38能有效经外周静脉途径通过血脑屏障，发挥减轻局灶性脑缺血再灌注损伤的作用，其机制与减少自由基生成有关。

　　【关键词】 垂体腺苷酸环化酶激活肽;局灶性脑缺血再灌注损伤;神经保护

　　The Protective effect of PACAP38 through peripheral vein in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury　　Shi Xiuli, Wang Chuanming, Yang Ying,et al　　The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022

　　[Abstract] Objective To investigate the protective effect of given PACAP38 through peripheral vein in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods The models of middle cerebral artery occlusion in rats were established with suture-occluded method. PACAP38 was injected at 6h, 12h, 24h, 48h and 72h respectively after 2h- cerebral ischemia through peripheral vein. which was 48h, focal cerebral ischemia reperfusion. Then picked up the Brain tissues were removed after PACAP38 being maintained 48 hours, and the area of cerebral infarction were measured,the activity of superoxide dismutase(SOD), the content of malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) were detected. The control group which was injected normal saline(NS) were established as well.Results PACAP38 could reduce the area of cerebral infarction significantly, increase the activity of SOD and decrease the content of MDA and NO.The above items were changed obviously at 6h after cerebral reperfusion.Conclusion PACAP38 given through peripheral vein effectively could penetrate the blood-brain-barrier and lighten the ischemia-reperfusion injury of focal cerebral. The mechanism of it was related to reducing the generation of free radicals.

　　[Key words] Pituitary adenylate cyclase activating poly-peptide(PACAP); Focal cerebral ischemia-reperfusion injury; Neuroprotection

　　脑梗死是临床常见病，但多年来缺乏新型的有效治疗药物，这与脑梗死后损伤机制复杂有关，诸多病理环节中自由基生成增多是主要原因之一[1]。因此减少自由基生成是治疗的关键。垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating poly-peptide PACAP) 是1989年从羊下丘脑发现的神经肽，包括PACAP38和PACAP27两种，中枢神经系统中以PACA38为主[2]。我们以往研究表明脑室内注射PACAP38能减轻脑缺血再灌注损伤，但临床上患者大多通过静脉输液途径接受治疗，PACAP38能否通过外周途径进入脑内发挥脑保护作用，以及脑保护有效时间窗的问题，尚未见报道，因此此次实验中，我们就上述问题进一步研究，为临床研究利用PACAP38提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 PACAP38，纯度为≥95%，相对分子质量1174(北京博奥森生物技术有限公司);AQP4(Aquaporin4)试剂盒(BOSTER);图像分析系统(Metamorph);简易大鼠静脉输液装置，硅胶管(外径1 mm,上海新亚医用橡胶厂);纯自控型艾克孚硅胶囊注入器(2 ml/h,Accufuser)。健康雄性SD大鼠，5月龄，体重280～330 g，安徽医科大学实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型制作、模型筛选及分组 采用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗阻(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[3]，制作方法加以改进。结扎大鼠颈总和颈外动脉，自颈总动脉向颈内动脉插入栓线约(18.5±0.5)mm，阻断大脑中动脉血流，造成大脑中动脉梗阻，缺血2 h后在麻醉状态下轻拔线栓，使得大脑中动脉血流再灌注。然后对大鼠神经功能进行评分,标准采用 Longa E 6分法:无功能障碍为0分,不能伸展对侧前肢为1分,向对侧旋转为2分,向对侧倾倒为3分，无自主活动伴意识障碍为4分,死亡为5分。评分为0分和5分者均被剔除。成功模型随机入选，每组10只。脑缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五个实验组，以T6、T12、T24、T48和T72表示，静脉输入PACAP38，对照组，以T表示，静脉输入生理盐水。

　　1.2.2 外周静脉途径的建立和给药方法 选择右侧颈外静脉植入硅胶管2 cm，0号丝线固定，整个操作过程需要大约10 min，全过程保持0.9%生理盐水持续缓慢输注，防止硅胶管头端血栓形成。PACAP38实验组分别在脑缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时将PACAP38(浓度为80 pmol/ml)加入纯自控型艾克孚硅胶囊注入器中，输注速度2 ml/h，维持48 h。静脉输液前每只模型静脉注射5pmol PACAP38，达到饱和PACAP38结合蛋白，提高血PACAP38浓度的目的。对照组操作过程与上述相同，但输入的是生理盐水。

　　1.2.3 脑梗死体积测定 静脉输入PACAP38或生理盐水完毕后，将大鼠断头取脑, 剔除嗅脑、低位脑干及小脑,将大脑放入-20℃冰箱10 min后，制作冠状切片,然后立即置于2%红四氮唑(TTC, PBS配置)溶液当中, 37℃避光孵育30 min。经染色后,正常脑组织呈玫瑰红色,而坏死区呈白色,利用图像分析系统计算脑梗死体积百分比，按下列公式进行:脑便死体积(%) =(苍白区体积/大脑总体积)×100%。

　　1.2.4 脑组织SOD活性、MDA含量、NO含量测定 实验中采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法、硝酸还原酶法分别检测SOD活性、MDA含量、NO含量，具体步骤按试剂盒说明进行。

　　1.3 统计学处理 定量数据用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，并进行线性相关分析，用SPSS 10.0软件进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 PACAP38对脑梗死体积的影响 脑缺血再灌注后五个时间点给予PACAP38均能明显降低脑梗死体积，再灌注后6 h时给予PACAP38减轻脑梗死体积最为明显，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(见表1)表1 PACAP38对脑梗死体积的影响注：与对照组比较，*P<0.05

　　2.2 PACAP38对脑组织SOD活性、MDA和NO含量的影响 脑缺血再灌注后给予PACAP38，能明显增加SOD活性，降低MDA和NO含量，再灌注后6 h时给予PACAP38上述变化最为明显，再灌注72 h时给予PACAP38仍具有这种作用，与对照组比较具有统计学差异(P<0.05)。Pearson相关分析显示，对照组脑组织SOD活性与脑梗死体积呈负相关(r=-0.77)，对照组脑组织MDA和NO含量与脑梗死体积变化呈正相关(r=0.82)。(见表2、3、4)表2 PACAP38对脑组织SOD活性的影响注：与对照组比较，*P<0.05表3 PACAP38对脑组织MDA含量的影响注：与对照组比较，*P<0.05表4 PACAP38对脑组织NO含量的影响注：与对照组比较，*P<0.05

　　3 讨论

　　急性脑缺血再灌注造成的神经损害远比单纯脑组织缺血更为严重，再灌注损伤机制包括自由基生成增多、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸过度释放和炎性介质损伤等，自由基异常增多是其主要机制[4]。脑缺血再灌注后体内的抗氧化防御系统功能失调，细胞内自由基清除系统的主要成员SOD活性降低，导致自由基大量产生[5]。并且脑缺血后由于细胞内钙浓度增加激活一氧化氮合酶，NO大量产生，NO和超氧阴离子自由基结合后在酸性条件下分解为毒性更大的羟自由基等[5，6]。这些迅速增多的自由基直接攻击脑细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸和脂肪酸的不饱和双键，改变细胞膜的通透性，钙离子内流，兴奋性氨基酸释放，加重脑细胞损伤。同时脑细胞膜发生的脂质过氧化反应，可形成一系列的脂质自由基及其降解产物MDA，形成恶性循环[6]。因此，SOD活性、NO和MDA含量可反应自由基生成和脑缺血再灌注损伤的情况，阻断自由基异常生成，可直接减少脑缺血再灌注对神经细胞的损害。

　　PACAP是一种新型的神经肽，属于分泌素、胰高血糖素、血管活性肠肽和生长激素释放激素家族的新成员。PACAP具有PACAP27和PACAP38两种活性形式，它们来源于同一含176个氨基酸残基的前体分子，前体分子量为19458，其中位于His132～Lys169之间的38个氨基酸残基的多肽称为PACAP38[7]。在不同组织或系统中，PACAP可以发挥神经递质/调质或神经营养因子等生物学功能。PACAP38对于神经元的生理作用，主要是在胚胎发育早期或在成熟的大脑中，通过与PACAP I型受体结合，激活磷酸肌醇和cAMP通路，抑制磷酯酶C，直接刺激交感神经元神经肽Y的释放，抑制神经凋亡，发挥其对神经元的营养或保护作用[8，9]。

　　临床上大脑中动脉梗死最为多见，而SD大鼠存在与人类相似的较完整的大脑底动脉环，能够实现脑缺血再灌注过程。所以本次实验利用SD大鼠制备MCAO模型，脑缺血再灌注后通过外周静脉持续给予PACAP38，结果显示PACAP38能有效减少脑梗死体积，宏观上体现了其明确的脑保护作用。PACAP38能有效地提高SOD活性，降低MDA和NO含量，减少自由基生成可能是其脑保护作用机制之一，且越早应用脑保护作用越明显。脑缺血再灌注72 h时给予PACAP38仍有脑保护作用，为保护缺血再灌注损伤的脑细胞提供了较充足的治疗时间窗。同时明确外源PACAP38能经外周静脉途径进入脑内发挥生物学效应，为临床进一步研究应用PACAP38奠定基础。

　　【参考文献】

　　[1] 耿美玉,辛现良,李 静,等.脑缺血的发病机制及其防治药物//张均田.神经药理学研究进展.北京：人民卫生出版社，2002:66～91.

　　[2] Miyata A, Arimura A, Dahl RR, et al. Isolation of novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells . Biochem Biophys Res Commun,1989, 164(1): 567-574.

　　[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke, 1989,20(1):84-91.

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　　[7] Miyata A, Arimura A,Dahl RR,et al.Isolation of a novel 38 residuehypothalamic polypeptide which stimulate adenylate cyclase in pituitary cells.Biochem Biophys Res Commun,1989,164:567.

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　　[9] Dickinson T，Mitchell R，Robberecht P，et al.The role of VIP/PACAP receptor subtyjpes in spinal somatosensory processing in rats with an experimental peripheral mononeruopathy.Neurpharmacology，1999，38(1)：167-180.