慢性阻塞性肺疾病患者痰中ＴＮＦ-α及其受体水平与气流受限的关系

　　作者：曾勉,刘凌云,王辉,关开泮　　作者单位：中山大学附属第一医院呼吸内科， 广东 广州

　　【摘要】 【目的】 观察慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者治疗前后气道内炎性介质与抗炎介质水平变化，阐明COPD气道局部炎症与气流受限的关系。【方法】 检测48例COPD急性加重期患者入院时(A1组)及治疗1周后(A2组)诱导痰肿瘤坏死因子?α(TNF-α)和可溶性肿瘤坏死因子受体55、75(sTNF-R55、sTNF-R75)的水平并进行肺功能测定。以28例健康志愿者(吸烟者，B1组;不吸烟者，B2组)为对照组进行分析治疗前后炎症因子及肺功能变化。【结果】 AECOPD治疗前后诱导痰中TNF-α和sTNF-R55、sTNFR75的水平均高于健康组(P < 0.01)。治疗后诱导痰中TNF-α浓度较入院时明显下降[A2组(478 ± 266)pg/mL vs A1组(820 ± 343)pg/mL，P < 0.001];sTNF-R55浓度明显上升[A2(4.0 ± 1.9)ng/mL vs A1(3.4 ± 1.4)ng/mL，P < 0.05)，sTNFR75水平亦有所升高。AECOPD患者TNF-α浓度与FEV1、FEV1%pre呈负相关(rTNF-α分别-0.524、-0.490，P < 0.01)，而sTNF-R55和sTNF-R75水平均与FEV1、FEV1%pre、FEV1/FVC呈正相关(rsTNF-R55分别为0.547、0.312、0.220，P < 0.001;rsTNF-R75分别为0.626、0.436、0.273，P < 0.01)。对照组吸烟者TNF-α水平高于不吸烟者，且B1、B2组各细胞因子水平与肺功能无明显相关性。【结论】 AECOPD患者气道内存在炎性介质与抗炎介质失衡，治疗后sTNF-R55水平上升，TNF-α水平降低，两者重新趋于平衡。抗炎介质水平的增加可能有利于临床肺功能的改善。

　　【关键词】 阻塞性; 肺疾病; 诱导痰; 肿瘤坏死因子-α; 可溶性肿瘤坏死因子受体

　　慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以气流受限为特征的疾病，研究证实气道炎症尤其是小气道炎症是COPD的主要病变和发病的主要原因，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在气道局部炎症中起重要作用[1]。但到目前为止，诱发和控制慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease， AECOPD)炎症的机制尚未清楚，可能与气道内炎症因子与抗炎介质的失衡，或内源性抗炎机制缺陷有关[2]。肺实质和气道中可溶性肿瘤坏死因子受体(soluble tumor necrosis factor receptor， sTNFR)可能是一种抗炎介质，它可以阻断TNF-α的生物活性，减轻TNF-α诱导的气道炎症[3]。气道局部炎症机制的研究方法有多种，诱导痰技术由于安全可靠等原因，更适合进行气道局部炎症机制的研究。为此，我们通过测定COPD急性加重期以及治疗后患者诱导痰液中TNF-α和sTNF-R55、sTNF-R75的水平，探讨COPD急性加重期患者气道内炎症介质与抗炎介质的变化，阐明TNF-α系统及TNF-α/sTNF-R失衡在COPD气流受限及气道炎症反应中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 研究对象的选择 收集2004年1月至2006年3月在我院呼吸科住院的62名中-极重度AECOPD患者。他们均符合慢性阻塞性肺疾病全球创议(global initiative for chronic obstructive lung disease，GOLD)[4]的诊断标准，并除外哮喘、支气管扩张、肿瘤、结缔组织病、糖尿病、甲状腺功能亢进等疾病。合并高血压病、严重左、右心功能衰竭(心功能Ⅲ、Ⅳ级)者不纳入研究范围。

　　支气管舒张试验和COPD的诊断使用肺功能仪(sensor medics Ltd， USA)，痰诱导过程中监测肺通气功能采用便携式肺功能仪(micro medical公司，英国)。

　　1.1.2 COPD急性加重诊断标准 AECOPD的诊断参照文献[5]的标准。

　　1.1.3 治疗和知情同意 入院后均使用?茁-内酰胺类或喹诺酮类抗生素及平喘祛痰治疗，不使用糖皮质激素。对入选患者均告知本研究目的及试验方法，并签署知情同意书。

　　1.1.4 健康对照者 选择年龄匹配( ± 2岁)健康对照者30例。其中分吸烟健康组和不吸烟健康组。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 诱导痰的采集、处理和质量控制 参照文献[6，7]的方法进行。整个过程尽量在2 h内完成。取无唾液成份的痰液放入离心试管中，加4倍体积的1 g/L二硫苏糖醇孵育，螺旋振荡15 min，加入与二硫苏糖醇等体积的Hank?蒺s液，再置于37 ℃恒温水浴振荡箱振荡15 min使其均匀，3 500 r/min(r=15 cm)，离心20 min，沉淀细胞作痰液质量检查，上清液于-80 ℃冻存待测。沉淀细胞用Hank?蒺s液悬浮，在血细胞仪上计数细胞总数，用台盼蓝染色排除法测定细胞存活率。调节细胞悬浮密度至1 × 106，将75 μL悬浮液置于细胞离心机450 r/min离心6 min，细胞沉渣涂片，风干，吉姆萨染色，每张涂片计数400个细胞。分类计数，鳞状上皮细胞 < 20%，细胞存活率 > 50%提示痰来源于下呼吸道，为合格标本，可进行有关生化测定。

　　1.2.2 TNF-α和sTNF-R55、sTNF-R75的测定 诱导痰中TNF-α和sTNF-R55、sTNF-R75的测定应用美国BIOSOURCE试剂盒，应用ELISA 法分别检测其含量，操作按试剂盒说明书进行。

　　1.2.3 肺功能检测 所有观察对象均使用肺功能仪测定FEV1，FVC，并计算出第一秒用力呼气流量占预计值百分数(FEV1%pre)和FEV1/FVC等。

　　1.3 统计学处理

　　AECOPD前后各项指标采用配对t检验，与对照组比较采用独立样本t检验。各组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)、组间两两比较用SNK-q检验，诱导痰TNF-α、sTNF-R55、sTNF-R75水平与肺通气功能指标的相关性采用Pearson相关分析。所有数据的计算、统计分析均用SPSS13.0软件处理，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 患者一般情况和肺功能状况

　　62例AECOPD患者入院当天和治疗第7天缓解后分别进行痰诱导，其中有10例患者不能耐受痰诱导过程，4例痰标本质量不合格而退出研究，最终顺利完成痰诱导且痰标本合格患者有48例(A1、A2组)。一般情况和肺功能指标(表1)。其中COPD严重程度分级为COPDⅡ级(FEV1值为50% ～ 80%)3例(6.25%)，Ⅲ级(FEV1值为30% ～ 49%)36例(75%)，Ⅳ级(FEV1 < 30%) 9例(18.75%)。

　　30例对照者中2例痰标本质量不合格退出研究，28例进入研究。吸烟者14例(B1组)，不吸烟者14例(B2组)。

　　各组年龄无显著性差异。A1、A2、B1 3组吸烟指数也无显著性差异。AECOPD治疗前后血气、肺功能各指标的比较差异有统计学意义，治疗后肺功能明显改善，但仍低于吸烟健康组和不吸烟组;不吸烟组的肺功能比吸烟对照组好。四组间FEV1和FEV1占预计值%的差异有统计学意义，而PaCO2无明显差异(表1)。

　　2.2 急性加重期与治疗后诱导痰中TNF-α和sTNF-R55、sTNF-R75的水平

　　急性加重期患者治疗后痰中TNF-α水平显著下降(P < 0.001)，sTNF-R55和sTNFR75水平数值上有上升，但前者P < 0.05，后者P > 0.05;AECOPD治疗前和治疗后诱导痰中TNF-α和sTNF-R55、sTNFR75的水平均高于健康吸烟组和不吸烟组，P < 0.01。吸烟健康组(B1)TNF-α水平高于不吸烟组(B2)，sTNF-R55水平低于不吸烟组。sTNFR75水平两组统计学无差异(表2)。

　　2.3 痰TNF-α和sTNF-R55、sTNF-R75的水平与肺通气功能的关系

　　本研究共检测48例AECOPD患者入院第1天及治疗第7天的肺通气功能，总共96例次肺通气功能。痰TNF-α水平与肺通气功能指标FEV1、FEV1%pre呈负相关性;痰sTNF-R55和sTNF-R75水平与FEV1、FEV1%pre、FEV1/FVC呈正相关性。控制TNF-α因素后，sTNF-R55和sTNF-R75与FEV1偏相关有意义，提示sTNF-R与肺功能相关不受TNF-α的影响(表3)。而吸烟组健康组和不吸烟组与肺功能各指标无明显相关性(P > 0.05)。PaO2与TNF-α、sTNF-R55和sTNF-R75水平无明显相关性，P > 0.05。

　　3 讨 论

　　COPD的进展与患者肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关[1]。TNF-α是具有广泛生物活性的促炎细胞因子，在COPD炎症反应中起核心作用。COPD患者诱导痰和血浆中均发现TNF-α水平较非COPD患者明显增高[8]。目前为止，诱发AECOPD炎症机制尚未明确，可能由于致炎介质和抗炎介质的失衡所致[2]。研究发现AECOPD、缓解期、稳定期患者诱导痰细胞以中性粒细胞为主，气道局部中性粒细胞增多与各期COPD患者气流受限存在密切关系[7]。

　　可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNF-R)能阻断、减少TNF-α与其靶细胞上的TNF-R结合从而拮抗TNF-α生物学活性[3]。sTNF-R包括sTNF-R55、75两种，是机体受抗原刺激后免疫细胞活化，TNF-α的合成和分泌增加，诱导膜TNF-R 脱落、水解而形成[9]，对TNF-α的功能起着重要的调节作用，TNF-α、膜TNF-R及sTNF-R组成TNF-α系统。Dentener[2]发现AECOPD患者治疗后血浆中抗炎介质可溶性白介素-1受体Ⅱ(soluble interleukin 1 receptor Ⅱ， sIL-1RⅡ)增多，而中性粒细胞和细胞因子白介素8(interleukin 8， IL-8)减少，故认为COPD急性加重与全身炎症介质和抗炎介质的失衡有关。本研究证实了AECOPD患者气道局部也有炎症介质和抗炎介质的失衡：急性加重期患者入院第一天痰中TNF-α水平明显增高，经过治疗后，TNF-α水平明显下降，且TNF-α水平与反映气流受限程度指标FEV1、FEV1%pre呈负相关，提示COPD加重期的气流受限程度与炎症介质TNF-α密切相关，也证明了TNF-α作为一种炎症介质在COPD的发病过程中起推动作用。sTNF-R水平则与之相反，COPD急性加重期间sTNF-R55和sTNF-R75水平较低，经治疗后sTNF-R55、75水平随之升高，TNF-α和sTNF-R两者重新恢复平衡，气道炎症减轻，气道阻塞改善，病情亦随之出现缓解。且sTNF-Rs与FEV1、FEV1%pre呈正相关，偏相关分析发现控制TNF-α因素后sTNF-R55、sTNF-R75水平仍与肺功能正相关，从而说明sTNFR水平与肺功能关系不受TNF-α的影响。然而有研究[10]认为sTNF-R55、sTNF-R75可能是一种致炎介质，因为发现COPD患者sTNF-R55、75水平较健康吸烟者增高，但这些研究的缺陷在于没有比较COPD急性加重及治疗后sTNF-R55、sTNF-R75的动态变化，sTNF-R55、sTNF-R75的升高正是机体为对抗TNF-α升高而出现的保护性升高。此外，本研究经治疗后的患者气道内TNF-α、sTNF-R55、sTNF-R75水平均高于健康吸烟者和不吸烟健康者，与Takabatake[10]报道一致，提示COPD缓解期仍存在TNF-α系统活化，炎性介质与抗炎介质失衡，TNF-Rs 高浓度时有拮抗TNF-α作用，而低浓度时则可作为致炎介质增强TNF-α的活性[3]。

　　有研究报道慢性缺氧、烟雾刺激会活化TNF-α系统，PaO2低于60 mmHg的COPD患者血清TNF-α、sTNF-R55、sTNF-R75水平显著高于PaO2 > 60 mmHg的COPD患者，且COPD低氧血症与循环中TNF-α及TNF-Rs水平负相关[10]，本研究入选的COPD患者平均PaO2 > 60 mmHg，相关分析未发现PaO2与TNF-α系统有关联。本研究吸烟健康者的痰TNF-α水平高于不吸烟者，sTNF-R55水平低于不吸烟者(P<0.05)，提示吸烟对TNF-α/ sTNF-R系统失衡有一定作用，可能削弱内源性抗炎机制，使COPD炎症持续。

　　综上所述，本研究证实COPD患者急性加重与局部炎性介质和抗炎介质失衡有关，进而促进COPD病情进展。抗炎介质水平增加有利于临床肺功能的改善。吸烟可削弱COPD患者内源性抗炎机制，导致气道局部炎症持续。诱导痰检查适合COPD局部气道炎症的研究。