麻辛平喘汤对哮喘豚鼠肺组织中IL5 mRNA表达影响的实验

　　作者：范华,黄静,孙艳,张晓霞　　作者单位：(黄石市中医医院，湖北黄石435000)

　　【摘要】目的研究麻辛平喘汤对哮喘豚鼠肺组织中IL5 mRNA表达的影响。方法将56只符合实验标准的豚鼠随机分为7组，采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏与雾化吸入激发的方法建立豚鼠哮喘模型。2周后处死豚鼠,取肺组织,采用RTPCR法检测IL5 mRNA的表达情况。结果麻辛平喘汤高、中、低剂量组及正常对照组肺组织IL5 mRNA表达量较低，与模型对照组相比差异有高度统计意义(P<0.01)。高剂量组的IL5 mRNA表达与正常对照组之间差异无统计意义(P>0.05)。 结论麻辛平喘汤可以从基因水平上调控IL5 mRNA转录。

　　【关键词】 麻辛平喘汤;哮喘;IL5;基因转录

　　Abstract： ObjectiveTo study the influence of Maxin Pingchuan Decoction on IL5 mRNA express in lung tissue of guinea pig. Methods56 guinea pigs with the experimental criteria were randomly divided into 7 groups, with ovalbumin (OVA) was injected in abdominal cavity and inspired by inhalation in asthmatic guinea pigs. Guinea pigs were sacrificed after two weeks, using RTPCR detected the expression of IL5 mRNA in the lung tissue. ResultsIL5 mRNA express in Maxin Pingchuan Decoction high, medium and lowdose groups were lower than the control group, there were significant differences (P<0.01). IL5 mRNA express in highdose treatment group and the normal group had no significant difference (P>0.05). ConclusionMaxin Pingchuan Decoction can control the transcription of IL5 mRNA from gene levels.

　　Key words: Maxin Pingchuan Decoction; asthma; IL5; gene transcription

　　支气管哮喘是一种以气道高反应性为特征的变态反应性炎症性疾病,是由嗜酸性粒细胞(ESO)、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。炎性递质和细胞因子在其发病过程中具有重要作用[1]，而IL5是哮喘发病中突出的炎性细胞因子[2]。运用中药治疗哮喘是我国的一大特色，具有明显的创新性。我们在长期的临床实践中，运用麻辛平喘汤(由麻黄、细辛、桂枝、地龙、白芍、全蝎等中药组成)治疗哮喘，取得了良好的疗效。为进一步探讨中药麻辛平喘汤治疗哮喘的作用机制,笔者将其对哮喘豚鼠肺组织中IL5的影响做了初步观察研究，报道如下。

　　1实验材料及制备

　　1.1实验动物

　　普通级健康豚鼠(合格证号00005907)，雌雄各半，体质量(250±20)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，室内动物房分笼饲养，统一饲料，随意进食及饮水。

　　1.2实验用药

　　麻辛平喘汤(药物组成：麻黄、细辛、桂枝、白芍、全蝎、地龙、僵蚕、蝉蜕、法半夏、陈皮、射干、甘草等)，由黄石市中医医院制剂室提供。先声咳喘宁口服液 (南京先声东元制药有限公司，国药准字 Z32020967，批号 40-091003)。

　　1.3主要试剂与仪器

　　卵白蛋白 (sigma分装，A5378，武汉众一生物有限公司)，IL5放免试剂盒(美国R&D公司进口分装，上海西唐生物科技有限公司，0911122)，SYBR Green realtime PCR master mixplus(日本东洋纺织株式会社，TOYOBO)，鱼跃402A1超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)，Synergy 2多功能酶标仪(美国Biotek公司)，Olympus CX-41生物显微镜及成像系统。

　　1.4动物模型制备

　　采用卵白蛋白(OVA)注射雾化吸入法复制哮喘豚鼠模型。实验第l d，临时配制10 %卵蛋白生理盐水，每只豚鼠腹腔注射OVA溶液1 mL以致敏。注射后第15 d，将致敏豚鼠分别置透明密闭玻璃容器中，以1 % OVA生理盐水溶液按最大雾化量进行雾化吸入，出现呼吸频率加快、点头呼吸、咳嗽、鼻煽、抽搐等症状时为引喘成功，约连续激发7 d。

　　1.5分组及给药

　　56只豚鼠按体质量随机分为7组，每组8只(雄性4只，雌性4只)，包括正常对照组、模型对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，预防组。模型对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、预防组均采用雾化吸入法复制哮喘。正常对照组用等量生理盐水代替进行注射和雾化吸入。除预防组外，各组分别于造模第8 d起灌胃给药。低剂量组每只灌麻辛平喘汤 0.75 mL，中剂量组为1.5 mL，高剂量组为3 mL， 阳性对照组灌服先声咳喘宁0.5 mL，正常对照组、模型对照组灌服同体积的生理盐水1 mL。连续给药7 d。各组均于雾化吸入前给药。预防组在OVA注射第10 d，每只灌服麻辛平喘汤1.5 mL，连续灌胃给药5 d，再雾化吸入激发哮喘,即提前5 d给药，然后再进行激发，激发时不给药，其余所有处置与治疗组相同。

　　2方法

　　末次给药2 h后，将豚鼠麻醉，沿腹正中线剪开皮肤，下腔静脉放血处死，开胸，暴露气管，分离气管及肺脏。切取肺组织，吸去血迹，置于-80 ℃冰箱中保存，备用。

　　2.1RNA的提取

　　材料与仪器：灭菌过的枪头、匀浆器、EP管、去离子水、TRLzol Reagent、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、离心机。　步骤：(1)将大约100 mg肺组织放入研磨器，加入1 mL的TRLzol Rengent研磨20~30 min，直到看不到大块的组织。(2)将液体倒入灭菌后的EP管内，加三氯甲烷250 μL，上下颠倒充分混匀，静置5 min， 4 ℃离心10 min，13 000 r/min。(3)取上清液500 μL于另一灭菌过的EP管内，加入等量的异丙醇，混匀后放入4 ℃的冰箱15 min后取出，4 ℃离心10 min，13 000 r/min，倾倒出上面的液体，留在管底的白色沉淀即为RNA。(4)加入75 %的乙醇1 mL，4 ℃离心5 min，7 500 r/min。(5)将上面的液体倒出，只剩白色沉淀，再瞬时离心，尽量吸干管内的液体，晾干，再加入适量的去离子水加以溶解。

　　2.2逆转录

　　2.2.1准备材料逆转录试剂盒(TOYOBO，日本)。

　　2.2.2RT反应液的配制按表1配制RT反应液(配制在冰上进行)。

　　2.2.3反应条件反转录反应为42 ℃，20 min;反转录酶的失活反应为95 ℃，5 min。

　　2.3Realtime PCR

　　2.3.1材料SYBRGreen mix(日本TOYOBO公司)，上下游引物，cDNA，ddH2O。

　　2.3.2引物信息。

　　2.3.3步骤(1)反应体系：见表3。表3Realtime PCR的反应体系各取PCR扩增产物10 μL，加6×加样缓冲液，1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，100 V恒压电泳1.5 h，经0.5 μg/mL的溴化乙淀(EB)染色10 min，于凝胶成像系统中照相。并用凝胶成像系统自带分析软件分析，获得每一标本的IL5与内参βactin PCR扩增产物的光密度比值，确定IL5 mRNA表达半定量值。

　　2.4统计学方法

　　统计学分析应用Origin 6.0软件进行，所有计量资料数据均用±s表示，组间比较采用两样本均值的t检验，相关分析采用双变量直线回归与相关性分析。

　　3结果

　　actin电泳图图1(B)actin荧光定量PCR扩增曲线图图2(A )IL5电泳图图2(B)IL5荧光定量PCR扩增曲线图图，分别为actin和IL5的电泳跑胶图，图中条带清晰单一，说明PCR产物为特异性扩增。为适时荧光定量PCR扩增曲线图。各组哮喘豚鼠肺组织中IL5 mRNA表达的半定量分析从表4可以看出，模型对照组IL5 mRNA表达明显升高，麻辛平喘汤高、中、低剂量组及正常对照组IL5 mRNA表达量较低，与模型对照组比较差异有高度统计意义(P<0.01)。高剂量组IL5 mRNA表达与正常对照组之间差异无统计意义(P>0.05)。上述结果提示麻辛平喘汤可以从基因水平上调控IL5 mRNA转录，可能是其抑制哮喘发作的一个有效机制。阳性对照组与正常对照组比较差异有高度统计意义(P<0.01)，与模型对照组比较差异无统计意义(P>0.05)，提示其作用靶点可能与麻辛平喘汤不完全相同。

　　4讨论

　　研究表明，哮喘的本质是气道慢性变态反应性炎症，其特点是气道高反应性。这种慢性炎症具有4大特点:(1)它的浸润细胞是以嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞为主;(2)这种变态反应的炎症一旦存在，不管发作期、缓解期，始终存在;(3)各种类型的支气管哮喘皆存在这种炎症;(4)这种炎症能被激发，也能被抗炎治疗所控制[3]。细胞因子在哮喘气道炎性反应的形成中起着重要的作用,在目前所发现的白介素( interleukin, IL)中, IL1到IL5均是以促炎作用为主的细胞因子[4]，主要由活化的辅助型T细胞亚型Th2分泌,

　　其次来源于肥大细胞和嗜酸性粒细胞。IL5是Th2淋巴细胞产生的一种细胞因子，它可以促使EOS最终分化，激活成熟EOS并延长其存活时间[5]。IL5能增强EOS对血管内皮细胞的黏附能力并对EOS具有强烈的趋化作用，此外，IL5对EOS毒性蛋白的释放及其本身细胞毒作用都具有明显的强化作用。许多研究都表明IL5由于对EOS具有重要的调节作用从而参与哮喘的发病过程。

　　有研究显示，由于哮喘气道中IL5 mRNA表达水平增高，由其编码而合成的IL5蛋白产物也应有所增多[6]。事实上，免疫组织化学研究也表明哮喘发病时气道黏膜组织中表达IL5的细胞显著高于正常水平，并与浸润黏膜组织的EOS数呈明显的正相关关系。有资料指出哮喘症状发作时BALF及血中IL5水平增高，而当症状缓解后IL5水平即随之下降[7]。本实验通过观察麻辛平喘汤对哮喘豚鼠肺组织中IL5 mRNA的表达，旨在从基因调控水平上探讨哮喘的发病机制和抗哮喘药物的作用机制，结果表明，哮喘豚鼠肺组织中IL5 mRNA表达增强且呈正相关;麻辛平喘汤可以下调IL5 mRNA的

　　表达，这与BALF及血中IL5的下调相一致，因此，下调IL5水平可能是麻辛平喘汤抑制哮喘气道炎症形成的重要机制之一。

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