盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠海马CA1区BDNF及ERK表达的影响

　　作者：张晓锋,陈淅泠△,王欣东　　作者单位：郑州大学第二附属医院干部病房 郑州

　　【摘要】 目的 探讨盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠海马神经元脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)及细胞外信号调节激酶(ERK)表达的影响。方法 健康雄性Wistar大鼠48只随机分为假手术组、模型组、盐酸美金刚组各16只，采用结扎双侧颈总动脉方法制备动物模型，用盐酸美金刚溶液灌胃，Y型迷宫测试学习记忆能力，HE染色观察大鼠海马神经元的形态学变化，兔疫组化染色检测BDNF及ERK的表达变化。结果 盐酸美金刚组大鼠的学习记忆成绩优于模型组，但不及假手术组，差异均有统计学意义(P<0.01);BDNF表达较模型组与假手术组均明显增高(P<0.01) ; ERK表达较模型组明显增高，却低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 盐酸美金刚有可能通过增加VD大鼠脑内BDNF含量，保护海马神经元，增加ERK含量，改善学习记忆能力。

　　【关键词】 盐酸美金刚;血管性痴呆;海马;BDNF;ERK

　　Effects of memantine on the expression of BDNF and ERK in hippocampal neurons of rats with vascular dementia Zhang Xiaofeng, Chen Xiling, Wang Xindong. Cadre Ward, the Second Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, China

　　【Abstract】 Objective To probe the effect of memantine on the expression of brainderived neurotrophic factor (BDNF) and extracellular signalregulated kinase (ERK) in hippocampal neurons of rats with vascular dementia(VD).Methods Fortyeight healthy male Wistar rats were divided randomly into shamoperated group, model group and memantine group. The models of VD rats were established through occlusion of permanent bilateral common carotid arteries. The rats from drug group were treated with memantine. The behavioral abnormalities were investigated by Ytype maze test. The changes of cell morphology and expressions of BDNF and ERK in hippocampal neurons were observed by HE stain and immunohistochemistry technique respectively.Results The grades of learning and memory of VD rats were obviously improved by memantine(P<0.01). Compared with model group and shamoperated group, the expression of BDNF increased significantly(P<0.01).The expression of ERK was higher than that of model group but lower than that of shamoperated group(P<0.01). Conclusion Decreased expression of BDNF and ERK might be involved in protection of hippocampal neurons and improvement of learning and memory in rats with vascular dementia.

　　【Key words】 Memantine; Vascular dementia; Hippocampus; BDNF;ERK

　　血管性痴呆(vascular dementia, VaD)是各种脑血管病引起的获得性智能损害和认知障碍的综合征，为一种慢性进行性疾病。作为一种神经保护剂，盐酸美金刚已被批准在临床中治疗阿尔茨海默病。Kavirajan等[1]进行的一项系统评价和汇总分析也证实了其对血管性痴呆的疗效以及较好的安全性和耐受性。目前的研究集中在盐酸美金刚为中等亲和力、非竞争性、电压依赖性NMDA受体阻断剂。最近的研究显示盐酸美金刚的神经保护作用可能涉及其他的作用机制[23]。本研究通过建立血管性痴呆的大鼠模型，观察大鼠的学习记忆能力、海马神经元的形态学变化及海马神经元BDNF和ERK表达，探讨盐酸美金刚治疗血管性痴呆的机制和神经保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物：健康雄性Wistar大鼠48只(河南省医学动物实验中心提供)，14～15月龄，体质量(400±50)g。

　　1.1.2 主要仪器及试剂：MG2 Y型迷宫(张家港市生物医学仪器厂)，BDNF和ERK免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，盐酸美金刚(商品名易倍申，丹麦灵北药厂制造)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组和模型制备：将大鼠随机分为假手术组、模型组和盐酸美金刚治疗组，每组16只。给予大鼠适应性饲养1周，采用双侧颈总动脉(CCA)永久结扎法制备模型。将大鼠用10%的水合氯醛(0.3 ml/100g)腹腔注射，麻醉成功后仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，模型组和盐酸美金刚组分离双侧颈总动脉, 4号丝线双重结扎后，缝合切口，放回笼中保温饲养。假手术组只分离双侧颈总动脉不结扎，余操作过程相同。药物治疗组于造模术后第2天按体质量3 mg/(kg•d)经胃管给予盐酸美金刚,1次/d,共6周。假手术组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

　　1.2.2 Y型迷宫试验：灌胃结束后用Y型迷宫测试学习记忆能力。将大鼠放入迷宫内适应5 min,使其对三臂均探索进入。然后从起步区臂出发,开始以随机次序变换测试。设定电压75 V，延迟5 s。电击后大鼠直接逃避至安全区为正确反应,否则为错误反应。每测1次休息30 s,测10次休息5 min。以连续10次测试中有9次正确反应即为达到学会标准，记录动物达到标准所需电击的次数，以此作为学习能力的指标。24 h后，重复以上实验过程，观察大鼠的记忆能力。每次测试均在安静的、光线稍暗的条件下进行。

　　1.2.3 HE染色和免疫组化技术：Y型迷宫试验后，将大鼠麻醉后,立即开胸暴露心脏,迅速左心室插管,同时剪开右心房,快速灌注生理盐水,待肝脏变白后, 改灌4%多聚甲醛溶液(4℃,pH=7.4)250 ml,速度先快后慢,至大鼠四肢僵硬为止,取出脑组织,置于4%多聚甲醛中浸置24 h,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋,连续冠状切片,片厚约5 μm,进行HE染色观察形态学变化,采用SP免疫组化法检测BDNF和ERK，步骤严格按说明进行。

　　1.2.4 图像分析及统计学方法：采用Qwin550 CW图像处理与分析系统，检测阳性反应物质的平均灰度值。每张切片同一区域中，随机选取8个视野，检测面积大致相同，采集8组数据，取其平均值作为该切片目标区域的平均灰度值。所有数据以均值±标准差表示，使用SSPS 13.0统计软件，采用单因素方差分析法，用SNK法进行组间的两两比较。P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Y型迷宫试验 盐酸美金刚组的学习和记忆成绩高于模型组，但不及假手术组，差异均有统计学意义。见表1。表1 各组大鼠学习记忆成绩注：与假手术组相比，*P<0.01;与模型组相比，#P<0.01

　　2.2 大鼠海马CA1区神经元形态学比较 假手术组神经元数量多，排列紧密、均匀、整齐，胞核呈圆形或椭圆形，核仁明显，染色质均匀;VD组神经元结构松散，数目减少，排列紊乱，胞核深染、固缩，核仁消失，胞浆周围发现空晕，胞间距较大;盐酸美金刚组正常神经元数量较多，排列较密，胞核呈圆形或椭圆形，核仁清晰，染色质丰富，少见固缩变性的神经元。

　　2.3 大鼠海马CA1区免疫组化结果 BDNF和ERK免疫阳性细胞胞浆内出现棕黄色颗粒。假手术组见少量弱染及中等强度染色的BDNF阳性神经元;模型组层次减少,排列疏松,但残余的BDNF阳性神经元胞浆内着色明显加重,呈棕黄色,并可见胞核着色;盐酸美金刚组BDNF阳性神经元数大量增加。假手术组海马CA1区有大量的ERK免疫反应阳性神经元,呈棕黄色,胞体较大,圆形或椭圆形;而模型组阳性神经元数目明显减少,胞体变小,核固缩;盐酸美金刚,可见阳性神经元数目较模型组增多，胞体变大。3组间的阳性区平均灰度值均有显著性差异。见表2。表2 各组大鼠海马CA1区BDNF和ERK阳性区平均灰度值 注：与假手术组相比，*P<0.01;与模型组相比，#P<0.01

　　3 讨论

　　本实验病理组织学检查发现, 盐酸美金刚能减少海马神经元的缺血坏死,减轻脑组织的不可逆损害,起到神经保护作用，血管性痴呆大鼠经盐酸美金刚治疗后Y型迷宫试验成绩得到提高，改善了其学习与记忆能力。

　　脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor) 对多巴胺能神经元及其他神经系统有营养及保护作用[2]，Miyake等[4]学者发现微球体梗死动物后,BDNF的蛋白水平在海马升高;同样, Zhao等[5]研究表明大鼠中动脉阻塞后,大鼠缺血侧前脑皮质和海马的BDNF水平也较对侧大脑半球高,暗示缺血后损害的恢复。本实验结果也显示，大鼠在慢性脑缺血后海马部位的内源性BDNF表达增高，但这种表达水平有限,难以对受损神经元起全面持久的保护作用,在应用盐酸美金刚后内源性BDNF显著上调,而且病理组织学改变相应减轻。ERK(含ERK1和ERK2),又称p44MAPK和p42MAPK,是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,pERK是其活性形式。ERK的底物包括细胞内其他重要的激酶、转录因子、组蛋白以及K+通道等,这些物质是细胞内的重要组成成分,在学习记忆形成过程中必不可少,同时ERK可能参与了神经元形态学可塑性的形成过程[6]。本研究发现ERK在模型组大鼠海马CA1区表达下降,因而推测VD模型大鼠学习记忆能力下降与海马CA1区ERK表达下降有关。应用盐酸美金刚治疗后，ERK表达增高，盐酸美金刚可能通过促进ERK表达改善学习记忆能力。但盐酸美金刚通过何种途径上调BDNF和ERK的表达，尚需进一步的研究。

　　综上所述，盐酸美金刚不仅可以通过拮抗NMDA受体过度活化造成的兴奋神经毒性作用，起到神经保护作用[7]，治疗血管性痴呆，也可能通过提高内源性BDNF表达，起到神经保护作用，增加ERK表达，改善学习记忆能力。本研究结果为研究盐酸美金刚治疗血管性痴呆的机制和神经保护机制提供了一个新的方向。

　　【参考文献】

　　[1] Kavirajan H, Schneider LS. Efficacy and adverse effects of cholinesterase inhibitors and memantine in vascular dementia: a metaanalysis of randomised controlled trials[J]. Lancet Neurol，2007,6(9):782792.

　　[2] Marvanova M,Lakso M,Pirhonen J,et al. The neuroprotective agent memantine induces brainderived neurotrophic factor and trkB receptor expression in rat brain[J].Mol Cell Neurosci，2001, 18:247258.

　　[3] Jantas D,Szymanska M,Budziszewska B,et al. An involvement of BDNF and PI3K/AKt in the antiapoptotic effect of memantine on staurosporineevoked cell death in primary cortical neurons[J].Apoptosis，2009,14:900912.

　　[4] Miyake K,Yamamoto W,Tadokoro M,et al.Alterations in hippocampal GA P43,BDNF,and L 1 follow ing sustained cerebral ischemia[J].Brain Res,2002,935:2431.

　　[5] Zhao LR,Risedal A,Wojcik A,et al.Enriched environment influences brainderived neuro trophic factor levels in rat forebrain after focal stroke[J].Neurosci Lett,2001,305:169172.

　　[6] 胡亚卓,吕佩源,李玲,等.盐酸多奈哌齐对血管性痴呆模型小鼠海马神经元ERK表达的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2008,15(1):4649.

　　[7] Lipton SA. Paradigm shift in neuroprotection by NMDA receptor blockade: memantine and beyond[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(2):160170.