慢性阻塞性肺病TNFA和LTA基因等位基因变异分析

　　作者：张瑛琪 卢宝全 作者单位：唐山市工人医院呼吸内科，河北 唐山 063000

　　【摘要】目的 中国北方汉族人群中研究TNF超家族基因等位基因变异是否与慢性阻塞性肺病(COPD)相关联。方法 以50例COPD患者为研究对象，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法研究TNF超家族基因(TNFA和LTA)等位基因变异分布。结果 TNFA基因多态性位点308G/A COPD组和对照组比较AA基因型频率分布差异显著(χ2=7.111,P<0.01),OR值为10.756(95%CI为9.875～12.640)。308G/A多态性位点A等位基因频率差异显著(χ2=8.219,P<0.01);LTA基因+252A/G多态性位点AG基因型频率分布COPD组与对照组比较差异显著(χ2=11.974，P<0.01)，OR值为4.373(95%CI为3.301～6.872)。LTA基因+252 A/G多态性位点G等位基因频率差异不显著。在COPD患者组中TNFA基因GG正常基因型和LTA基因AG杂合基因型结合个体频率比对照组显著增高(χ2=4.10，P<0.05)。结论 中国北方汉族人群LTA基因等位基因变异、TNFA基因多态性变异组合与COPD相关联。

　　【关键词】 慢性阻塞性肺疾病 TNFA基因 LTA基因

　　Analysis of TNFA and LTAgene allele variation in COPD

　　ZHANG YingQi，LU BaoQuan.

　　Department of Respiration of Workers′ Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei, China

　　【Abstract】 Objective To research whether TNFgene allele variation is associated with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) of Northern Han Chinese. Methods TNFsuperfamilygene (TNF and LTA) allele variation distribution were determined by PCRrestrictive segement length polymorphism method in 50 COPD cases. Results There was significant difference in AAgenotype frenquency distribution between COPD group with TNFgene polymorphism space point 308G/A and control group 〔(χ2=7.111, P<0.01), OR value for 10.756 (95%CI for 9.875～12.640)]. An allele of polymorphism space point 308G/A frequency also had significant difference (χ2=8.219, P<0.01); LTA gene +252A/G polymorphism space point AG allele genotype frequency had a significant difference between the two groups (χ2=11.974, P<0.01), OR value for 4.737 (95%CI for 3.301～6.872). LTA gene +252A/G polymorphism space point G allele frequency showed no significant difference. In COPD group TNFAgene GG normal genotype and LTAgene AG hybrid gene combinated individuals were significantly higher than that of control group (χ2=4.10, P<0.05). Conclusions LTAgene allele variation and TNFAgene polymorphism variation are associated with COPD.

　　【Key words】 COPD; TNFA; LTAgene

　　慢性炎症是慢性阻塞性肺病(COPD)发病过程中的重要特征。参与肺部炎症调节的细胞因子在COPD发病过程中起重要作用。肿瘤坏死因子α(TNFα)是一个多功能的细胞因子，它促进气道重构，改变平滑肌细胞功能，参与肺部炎症调节，从而在COPD发病过程中起重要作用。淋巴毒素α(LTα)也是炎症细胞介素，主要由淋巴细胞合成。两种细胞因子都与细胞表面的相同受体有关系。其编码两种细胞因子TNFA和LTA基因彼此连锁并位于6号染色体短臂(6p21.16p21.3)主要组织相容性复合体簇范围内。关于TNFA和LTA基因不同等位基因变异是否影响TNFα和LTα表达水平尚有争议。已证明与G等位基因比较，A等位基因与细胞因子产物成倍增高有关〔1，2〕。在亚洲某些群体发现TNFA基因的A等位基因与某些呼吸系统疾病表型关联，而在欧洲群体迄今未得到证实。LTA基因第一内含子+252A/G多态性对肺部疾病的作用研究很少。本文旨在探讨TNFA和LTA基因等位基因变异与COPD的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　所有COPD患者均为中国北方汉族人，病例组选取2004年12月～2006年2月本院呼吸科住院的COPD患者50例，诊断符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南〔3〕，年龄58～83(平均62.41±13.38)岁。对照组选取同期本院健康体检者，年龄56～79(平均58.92±12.53)岁，X线胸片和肺功能正常。同时均排除支气管哮喘、肺癌、肺间质纤维化等呼吸系统疾病及冠心病、高血压等具有遗传倾向的疾病。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA的提取

　　用标准苯酚氯仿法从外周血抽提基因组DNA。

　　1.2.2 PCR TNFA基因

　　308G/A和LTA基因+252A/G的检测用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法。308G/A位点引物序列正向为5′AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT3′;反向为5′TCCTCCCTGCTCCGATTCCG 3′。PCR产物为107 bp。+252A/G 位点引物序列正向为5′CTCCTGCACCTGCTCCTGGATC3′;反向为GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT3′。 引物由北京鼎国生物工程有限公司合成。PCR产物为368 bp。PCR反应总体系为25 μl，包括4 μl模板基因组DNA,10×PCR缓冲液2.5 μl，Mg2+浓度2.0 mmol/L,1 mmol/L dNTPs 2.5 μl,每条引物各5 pmol/L,TaqDNA聚合酶4 U (北京鼎国)，不足体积用灭菌双蒸水补充至25 μl。TNF基因308G/A PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性60 s，61℃(LTA基因+252A/G为64℃)退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环;最后72℃延伸7 min。扩增后取反应产物4 μl在2%琼脂糖凝胶上电泳15 min，120 V电压，紫外灯下鉴定PCR产物。

　　1.2.3 酶切条件及体系

　　采用限制性片段长度多态性检测TNFA和LTA基因的多态性。在20 μl体系中，加入10 μl PCR产物，10×缓冲液2 μl，NcoⅠ(北京鼎国)4 U(0.5 μl),不足体积用灭菌双蒸水补充，37℃孵育5～6 h。

　　1.2.4 TNFA和LTA基因多态性的分析

　　对于TNFA和LTA基因分别取酶切产物5 μl在含0.5 μg/ml溴化已锭的3%琼脂糖凝胶上电泳15～20 min，根据紫外灯下观察到的酶切产物片段长度鉴定等位基因并照相。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS11.5版软件进行χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 TNFA和LTA基因的突变位点及突变规律

　　TNFA基因308G/A多态性位点PCR产物经NcoⅠ酶切后电泳结果见图1。TNFA基因PCR产物长度为107 bp,G等位基因特点是存在NcoⅠ酶切点，可被切成87和20 bp两个片段。A等位基因无NcoⅠ酶切点为107 bp一个片段。所以，在电泳后GG基因型为87和20 bp两个片段;AA基因型为107 bp一个片段;AG基因型为107、87和20 bp三个片段。LTA基因+252A/G多态性位点PCR产物经NcoⅠ酶切后电泳结果见图1。LTA基因PCR产物长度为368 bp，其中A等位基因特点是缺少NcoⅠ酶切点为368 bp一个片段，G等位基因存在NcoⅠ酶切点被切成235和133 bp两个片段。所以，在电泳后AA基因型为368 bp一个片段;GG基因型为235和133 bp两个片段 ;AG基因型为368、235和133 bp三个片段。

　　2.2 HardyWeinberg平衡检验结果

　　在TNFA和LTA基因中，COPD组、对照组各种基因型频率的分布符合HardyWeinberg平衡规律。

　　2.3 TNFA基因

　　308G/A多态性位点基因型和等位基因频率的分布 见表1。COPD组与对照组比较，TNFA基因308G/A多态性位点AA基因型频率分布差异显著(分别为18%和2%;χ2=7.111,P=0.008),OR为10.756(95%CI为9.875～12.640)。308G/A多态性位点A等位基因频率差异显著(χ2=8.219，P=0.004)。表1 TNFA基因308G/A多态性位点基因型和等位基因的频率分布〔n(略)〕

　　2.4 LTA基因+252A/G多态性位点基因型和等位基因频率的分布

　　见表2。COPD组与对照组比较，LTA基因+252A/G多态性位点AG基因型频率分布差异显著(χ2=11.974，P= 0.001)，OR为4.373(95%CI为3.301～6.872)。LTA基因+252A/G多态性位点G等位基因频率差异不显著。表2 LTA基因+252A/G多态性位点基因型和等位基因的频率分布〔n(略)〕

　　2.5 TNFA和LTA基因多态性位点基因型组合关联分析

　　根据Warzocha等提出的高风险和低风险基因型,将所有可能的基因型组合分为两组〔4〕，仅存在一个与细胞介素高产物关联的等位基因(TNFA基因A等位基因或LTA基因G等位基因)的基因型组合属于低风险组：即GGAA，GGAG，GAAA组合。与TNFα或LTα增高分泌作用有关的两个以上等位基因的基因型组合列入高风险组：即GGGG、GAAG、GAGG、AAAA、AAAG、AAGG结合。基因型组合频率分布，见表3。COPD患者组与对照组之间高风险和低风险基因型组合频率无显著差异(χ2=0.10，P=0.73)。表3 TNFA和LTA基因多态性位点基因型组合关联分析〔n(略)〕

　　3 讨 论

　　本研究结果提示，TNFA基因AA基因型与我国COPD患者的易感性明显相关。与相关资料比较，本研究COPD患者TNFA基因A等位基因频率与日本和韩国COPD患者TNFA基因A等位基因频率相似〔5〕。但欧洲COPD患者中TNFA基因A等位基因与发病无关联。意大利COPD患者308A等位基因频率为11%，欧洲出生健康个体组和非阻塞性支气管炎患者组为10%，这与相应对照组A等位基因频率高有关系(8%～27%)。此外，Kucukaycan等〔6〕分析TNFA基因4个多态性变异发现+169G/A多态性与COPD关联，而等位基因308G/A、376G/A、238G/A变异未参加到疾病发生中。

　　本研究结果还显示COPD组与对照组比较，LTA基因+252A/G多态性位点AG基因型频率显著增高(P<0.01)，但G等位基因频率与A等位基因频率差别不大。患者组和对照组的LTA基因G突变等位基因频率为30%，这可能与研究的病例数较少有关。 Patuzzo等〔7〕研究了意大利COPD(n=66)患者LTA基因+252A/G多态性，未发现TNFA和LTA基因多态性变异与发病之间的关系。Yamaguchi等〔8〕研究日本的结节病患者的多态性发现，G等位基因是慢性病程标记基因。

　　一些研究表明，LTA基因突变可以影响LTα表达水平，可能对COPD发病机制具有意义。但是这个细胞介素生物学功能目前很少研究。已知LTA基因突变等位基因G与人类外周血单核细胞介素更多产物关联。此外，发现G等位基因处于与LTA基因编码区域的突变连锁，它引起蛋白质产物26位天门冬酰胺替代苏氨酸(Thr26Asn),可以影响LTα生物活性水平。但是为了证实这个假说尚需要进一步的研究。

　　Boichenko等研究人外周血淋巴细胞发现NFκB因子诱导和LTα诱导之间相关。而NFκB转录因子是炎症应答的许多基因表达调控的主要因子之一〔9〕。在氧化剂、细菌、病毒和不同抗原等作用下活化合成炎症细胞介素TNFα、IL1β、IL2、IL6、巨噬细胞和粒细胞克隆刺激因子，以及参加COPD病理过程的IL8。分析TNFA和LTA基因多态性位点基因型组合，每一个COPD类型可以划分出是标记基因的基因型组合。在COPD患者中常出现TNFA基因的GG基因型和LTA基因AG杂合基因型组合的个体。在COPD发生风险方面，这个基因型组合的个体中出现明显增高。

　　意大利研究者进行了健康对照组和COPD患者组之间组合类似分析〔7，10〕。COPD患者最常出现的GGAA组合频率为45%，对照组为45.9%。来自意大利COPD患者组GGAG组合频率(29.2%)没有超过健康对照组(31.5%)。但在COPD组观察到GGGG和GAAA组合频率增高倾向(2.4%比对照的0.8%和4.8%比对照的0.8%)。

　　本研究描述了LTA基因的基因型，以及TNFA和LTA基因的基因型组合，它们与COPD的易感性相关。在临床上可作为遗传性标记进行检测，用于早期发现COPD的易感人群，对于预防COPD的发生发展具有一定的实际意义。但几种基因型的多态性显然不能解释COPD发病中全部的基因调控机制及其遗传易感性〔11〕。

　　【参考文献】

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　　4 Warzocha K，Ribeiro P，Bienyenu J,et al.Genetic polymorphisms in the tumor necrosis factor locus influence nonHodgkin′s lymphoma outcome〔J〕.Blood,1998;91(10):357481.

　　5 Huang SL，Su CH，Chang SC.Tumor necrosis factorα gene polymorphism in chronic bronchitis〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,1997;156:14369.

　　6 Kucukaycan M，Van Krugten M，Pennings HJ,et al.Tumor necrosis factorα+489G/A gene polymorphism is associated with chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Respir Res,2002;3(29)：3514.

　　7 Patuzzo C，Gile LS，Zorzetto M,et al.Tumor necrosis factor gene complex in COPD and disseminated bronchiectasis〔J〕.Chest，2000;117:13538.

　　8 Yamaguchi E，Itoh A，Hizawa N,et al.The gene polymorphism of tumor necrosis factorβ，but not that of tumor necrosis factorα,is associated with the prognosis of sarcoidosis〔J〕.Chest,2001;119:75361.

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　　10 Ferrarotti I，Zorzetto M，Beccaria M,et al.Tumor necrosis factor family genes in a phenotype of COPD associated with emphysema〔J〕.Eur Respir J,2003;21(3):4449.

　　11 MA Zhiming，ZHANG Zhenxiang，HAN Zemin,et al.A study on relationship bet ween tumor necrosis factor a gene promoter polymorphism and susceptibility to development of COPD〔J〕.Pract Prev Med，2004;11(3):4179.