surwivinsiRNA对肺癌细胞A549增殖抑制的影响

　　作者：于振香 华树成 于水 作者单位：吉林大学第一医院呼吸科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 探讨survivinsiRNA对肺癌细胞A549的增殖抑制作用。方法 将针对survivin的siRNA表达载体与脂质体和pSiscrambled两个对照组一起分别转染肺癌细胞A549后，利用半定量RTPCR和Western印迹法分别检测细胞survivin mRNA及蛋白表达水平，MTT法测定细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果 转染72 h后，实验组细胞的survivin mRNA水平是脂质体对照组的31.1%，蛋白表达水平是脂质体对照组的29.2%。MTT检测实验组细胞的生长速度是脂质体对照组的36.6%，流式细胞术发现实验组G1期细胞比例明显高于两个对照组，而G2期和S期细胞比例减少，细胞出现凋亡。结论 利用survivinsiRNA可明显抑制肺癌细胞A549的增殖，细胞受阻于G1期，诱导细胞凋亡。

　　【关键词】 RNA干扰;survivin;肺癌;凋亡

　　基金项目：长春市科技局项目(2006039)

　　survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员〔1〕，选择性地表达于恶性肿瘤组织中，而在除胸腺和生殖腺外的正常成人组织中不表达，这种特点使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。有研究报道〔2〕，survivin反义寡核苷酸能有效抑制肺癌细胞株NCIH446 survivin mRNA和蛋白的表达，并诱导凋亡，抑制细胞生长。Fuessel等〔3〕分别利用survivin的反义寡核苷酸及siRNA转染膀胱癌细胞，发现二者均能降低细胞survivin表达水平，但siRNA的效果优于反义寡核苷酸，提示在肿瘤治疗方面，siRNA比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果更强。为探讨利用siRNA抑制survivin表达对于肺癌的治疗价值，我们利用基因工程技术重组survivin siRNA表达质粒，并转染人肺癌细胞A549，观察对其增殖抑制的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人肺癌细胞A549细胞株，中国科学院上海细胞研究所提供。质粒pGCsiU6/Neo/GFP购自上海吉凯基因化学有限公司，各种分子克隆工具酶为TaKaRa产品，DNA纯化试剂盒、RTPCR试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品，RPMI1640培养基为美国Hyclone公司产品，新生牛血清购自北京鼎国公司，转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司，兔抗人survivin抗体及羊抗兔二抗均为Santa Cruz公司产品，蛋白定量试剂盒为BioRad公司产品。其他试剂为进口或国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达载体pSisurvivin和pSiscrambled的构建〔4〕 设计的survivinsiRNA和scrambled对照cDNA 序列，以pGCsiU6/Neo/GFP为载体，构建表达载体测序鉴定。survivin siRNA 靶基因的cDNA序列(编码基因368386)：5′GCAGTTTGAAGAATTAAC3′。

　　1.2.2 细胞培养及质粒转染 利用Qiagen去内毒素质粒提取试剂盒，大量提取去内毒素的重组质粒pSiscrambled和pSisurvivin。接种A549细胞于100 ml培养瓶中，细胞数约1×106，用含10%新生牛血清但不含抗生素的RPMI1640培养液，在37℃培养至细胞占瓶底约80%～90%时，按Invitrogen公司的Lipofectamine2000使用说明书进行转染，质粒和转染试剂的比例为2∶1。转染分组情况如下：(1)脂质体对照组;(2)pSiscrambled对照组;(3)pSisurvivin实验组。

　　1.2.3 半定量RTPCR检测细胞survivin mRNA水平 转染72 h后，利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取A549细胞总RNA，RTPCR扩增目的基因survivin和内参基因βactin。反应体系中加入两对引物，第一对是survivin基因的引物，即 5′GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC3′和5′AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC3′，扩增片段长度为475 bp。第二对是βactin基因的引物，即5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′和5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，扩增片段长度630 bp。PCR反应条件：94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下拍照。

　　1.2.4 Western印迹法分析细胞survivin蛋白含量 转染72 h后收集细胞提取总蛋白，用Bradford法进行定量，取50 μg蛋白进行10% SDSPAGE凝胶电泳分析，电泳结束后转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1∶1 200稀释的兔抗人survivin一抗，室温作用3 h，TBST洗膜，加入1∶12 000稀释的羊抗兔IgG/HRP，室温温育1 h，TBST洗膜，用DAB显色。

　　1.2.5 MTT法检测细胞存活率 A549细胞培养于96孔培养板，将细胞分为3组，分别转染空脂质体、pSiscrambled和pSisurvivin质粒。转染68 h后，各孔分别加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃培养4 h，轻轻吸去上清，每孔加入100 μl DMSO，37℃振荡溶解30 min，在570 nm处检测吸光度值(A)。每组以三复孔检测，最终结果取三孔平均值。各组所得数据分别与脂质体组进行比较。

　　1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 转染后72 h收集106个细胞，用预冷PBS洗涤，1 000 r/min离心3 min，反复3次。弃上清液，收集细胞，混匀沉淀，快速加入75%冷乙醇中，4℃固定24 h，用流式细胞仪进行检测。

　　1.3 统计学分析 所有数据均以x±s表示，采用t检验进行各组间均数比较，用方差分析进行各组间差异的比较。

　　2 结果

　　2.1 siRNA抑制转染细胞survivin mRNA水平 转染后72 h提取细胞总RNA，利用半定量RTPCR方法检测survivin基因转录水平(见图1)。运用GIS凝胶分析软件光密度扫描分析，以脂质体对照组survivin产物与内参βactin产物的电泳亮度比值定为1，则其他各组的比值分别为：pSiscrambled对照组0.95，pSisurvivin实验组0.31。两对照组基本无差别，但实验组亮度明显减弱。结果表明重组质粒pSisurvivin在mRNA水平上抑制了survivin基因转录。

　　1：脂质体对照组;2：pSiscrambled对照组;3：pSisurvivin实验组

　　图1 SurvivinsiRNA抑制A549细胞survivin mRNA的RTPCR检测结果(略)

　　2.2 siRNA抑制细胞中survivin蛋白表达 转染72 h后提取细胞总蛋白进行Western印迹法分析(见图2)。光密度扫描分析以脂质体对照组的survivin与内参βactin的杂交带亮度比值定为1，则其他组分别为：pSiscrambled对照组0.93，pSisurvivin实验组0.29。与两对照组相比，实验组细胞的survivin蛋白表达受到了明显抑制。Western印迹法结果进一步证实了构建的siRNA质粒可在蛋白水平上抑制survivin表达。

　　1：脂质体对照组;2：pSiscrambled对照组;3：pSisurvivin实验组

　　图2 SurvivinsiRNA抑制A549细胞survivin蛋白的Western印迹法检测结果(略)

　　2.3 siRNA转染后细胞存活率 利用MTT法检测各组转染细胞的存活状态，以脂质体组的生存率作为100%，则pSiscrambled对照组，pSisurvivin实验组的生存率分别为94.7%、36.6%，实验组细胞出现了较大程度的生长抑制现象，与两对照组相比较，均具有显著性差异(P<0.01，图3)。

　　1：脂质体对照组;2：pSiscrambled对照组;3：pSisurvivin实验组

　　图3 SurvivinsiRNA转染A549细胞后的MTT检测结果(略)

　　2.4 siRNA转染后对细胞周期的影响 流式细胞术检测结果表明，转染survivinsiRNA后，细胞周期发生明显改变(表1)。实验组的G1期细胞比例均增加，高于脂质体对照组和空质粒对照组;实验组G2期和S期的细胞比例减少，低于两对照组。

　　表1 SurvivinsiRNA影响A549细胞的细胞周期的流式细胞术检测结果(略)

　　与两对照组比较：1)P< 0.05,2)P<0.01

　　实验组细胞与两对照组相比，出现了明显的细胞凋亡。

　　3 讨论

　　survivin是IAP家族的新成员，具有抑制凋亡和调节细胞增殖的双重作用，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，其编码的蛋白由142个氨基酸组成，分子量约为16.5 kD 〔1，5，6〕。survivin的组织分布有明显的选择性，除胚胎组织外，在正常成人组织中(除胸腺和生殖腺)不表达，但在几乎所有恶性肿瘤组织内均有表达，如肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等〔7～9〕。Falleni等〔9〕用定量即时PCR及免疫组化法检测了83例肺癌标本发现，survivin mRNA在80例(96%)中呈高表达;survivin 免疫染色在细胞质和细胞核分别为70%和80%，两者共同表达为54%。目前，survivin已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)最显著的独立预后影响因子之一〔10〕。survivin的选择性分布特点使其成为肿瘤基因治疗的理想靶点，针对survivin的基因治疗具有良好的靶向性、特异性和安全性，可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，但对正常组织几乎没有不良影响。

　　本研究利用针对survivin的siRNA表达载体，转染肺癌细胞A549后，可以抑制其survivin mRNA及蛋白表达，并能够显著抑制细胞的生长，流式细胞术检测进一步发现细胞生长受到了明显抑制，并出现凋亡，细胞多受阻于G1期。这说明了survivin在细胞G1期向S期转换中起着重要作用。这与Suzuki等〔11〕的研究发现一致，即survivin过度表达会导致细胞加快向S期转换，抵抗G1期抑制，从而促进细胞增殖。

　　通过研究我们发现，以survivin基因为靶点的RNAi能明显抑制肺癌A549细胞中survivin基因及蛋白的表达，使细胞受阻于G1期，诱导细胞凋亡，这为以survivin基因为靶点进行RNAi来治疗肺癌提供了可靠的实验依据。

　　【参考文献】

　　1 Ambrosini G，Adida C，Altier DC,et al.A novel antiapoptosis gene，survivin expressed in cancer and lymphoma〔J〕.Nat Med，1997;3:91721.

　　2 夏雪梅，陈余清，蔡映云，等.Survivin反义寡核苷酸诱导肺癌细胞株凋亡的研究〔J〕.蚌埠医学院学报，2005;30:49.

　　3 Fuessel S，Herrmann J，Ning S,et al.Chemosensitization of bladder cancer cells by survivindirected antisense oligodeoxynucleotides and siRNA〔J〕.Cancer Lett，2006;232(2)：24354.

　　4 刘喜春，于振香，高瑞娟，等.SurvivinsiRNA对裸鼠前列腺癌生长影响的研究〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(7)：6413.

　　5 Altieri DC.The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy〔J〕.Trends Mol Med，2001;7(12):5427.

　　6 Carvalho A，Carmena M，Sambade C,et al.Survivin is required for stable checkpoint activation in taxoltreated HeLa cells〔J〕.Cell Sci，2003;116(14)：298798.

　　7 Tanaka K，Iwamoto S，Gon G,et al.Expression of survivin and relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，2000;6(1):12734.

　　8 Sarela AI，Macadam RC，Farmery SM,et al.Expression of the antiapoptosis gene，survivin，predicts death from recurrent colorectal carcinoma〔J〕.Gut，2000;46(5):64550.

　　9 Falleni M，Pellegrini C，Marchetti A,et al.Survivin gene expression in earlystage nonsmall cell lung cancer〔J〕.J Pathol，2003;200(5):6206.

　　10 Singhal S，Vachani A，AntinOzerkis D,et al.Prognostic implications of cell cycle，apoptosis，and angiogenesis biomarkers in nonsmall cell lung cancer：a review〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(11):397486.

　　11 Suzuki A,Hayashida M,Ito T,et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16(INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation〔J〕.Oncogene，2000;19(29):322534.