磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体的构建及鉴定

　　作者：张越 杨洋 安继红 乔俊华 吴春风 于红霞 马忠森 作者单位：吉林大学第二医院呼吸内科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 构建磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体pcDNA3.1(+)，并进行酶切鉴定。方法 查得人SLC34A2 cDNA全序列，设计合成相应特异性引物，引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过RT-PCR获得SLC34A2基因，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中，构建重组体pcDNA3.1(+)-SLC34A2，通过酶切分析，PCR及测序鉴定，筛选阳性重组体。结果 从正常肺组织中逆转录扩增出的SLC34A2基因，大小约为2 073 bp，经双酶切及测序鉴定证明成功构建了SLC34A2真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-SLC34A2。结论 RT-PCR 扩增得到了大小约为2 073 bp 的SLC34A2基因;并成功构建了pcDNA3.1(+)-SLC34A2 真核表达重组载体。

　　【关键词】 磷酸钠协同转运蛋白;基因SLC34A2;真核表达重组载体

　　SLC34A2是编码磷酸钠协同转运蛋白的基因，表达在人体的多种组织中，以肺组织表达最高。该基因主要参与无机磷代谢，与肺泡微石症、睾丸微石症等多种代谢性疾病发病相关。目前对于这些疾病的治疗都没有很好的办法，SLC34A2基因是最近发现的此类疾病的致病基因〔1〕，克隆该基因并研究其在细胞钙、磷代谢中的功能，是治疗该类疾病的前提。但是尚无这方面的文献报道。因此，本研究采用RT-PCR 技术扩增SLC34A2基因，将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1 (+) 构建pcDNA3.1(+)-SLC34A2 真核表达重组载体，通过酶切分析、PCR 及测序鉴定，筛选阳性重组体，为研究该基因在细胞钙、磷代谢中的功能奠定实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 质粒及菌株 大肠杆菌DH5a(DH5a E.coli)菌株、pcDNA3.1(+)真核表达载体购自天根公司，新鲜的肺组织取自本院胸外科手术中。

　　1.1.2 酶、分子量标准及试剂盒 Marker Ⅳ、BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶购自天根公司，T4 连接试剂盒、DNA 回收试剂盒、Primer STAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司。

　　1.1.3 引物设计与合成 参考Genbank 收录的SLC34A2序列，设计两条引物，上游P1：5′-GCGGATCCTAATGGCTCCCTGGCCTGAAT-3′，含BamHⅠ酶切位点，下游P2：5′-GCGAATTCCTACAAGGCCGTGCATTCG-3′，含EcoRⅠ酶切位点。上述引物由上海生工公司合成并纯化。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织总RNA的提取 Trizol试剂提取新鲜肺组织总RNA，经电泳检测及测定A260/A280比值，选取比值在2.0左右的RNA样本，按Fermentas公司试剂盒说明书逆转录合成cDNA第1链。总RNA 2 μg，Oligo(dT)1 μl，引物(0.5 μg/μl) 1 μl，DEPC水补足12 μl，瞬时离心后，70℃温育5 min，取出后立即冰浴，加入5×反应缓冲液4 μl，RNA酶抑制剂(20 U/μl)1 μl,10 mmol/L dNTP 混合物 2 μl，瞬时离心混匀，37℃温育5 min，取出置冰上，加入：逆转录酶RevertAid TMM-MuLV(200 U/μl)1 μl，总体积20 μl，42℃温育60 min，之后70℃温育10 min终止反应。cDNA产物存于-20℃。

　　1.2.2 PCR 以制备好的cDNA为模板，采用引物P1,P2扩增目的片断。反应条件：94℃3 min，98℃10 s，68℃8 min，72℃ 2 min,共30个循环，末次延伸8 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

　　PCR扩增产物以2% 琼脂糖凝胶电泳检测发现明显阳性扩增条带后，切下含目的基因的凝胶块，放入一洁净1.5 ml Ep管中，按Tiangen公司小量胶回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物的胶回收纯化，纯化后的产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。

　　1.2.3 质粒载体和PCR 产物的酶切和纯化 分别以BamHⅠ和EcoRⅠ双切PCR产物和pcDNA3.1，酶切体系为：10×缓冲液4 μl，PCR产物 (pcDNA3.1)3 μl，BamHⅠ和EcoRⅠ各0.5 μl，补足双蒸水至20 μl。37℃过夜后胶回收酶切产物。

　　1.2.4 连接反应 按10∶1的摩尔比(PCR产物∶载体)采用TaKaRa公司快速连接试剂盒进行连接。取连接液10 μl加入200 μl DH5a感受态细胞中，冰浴30 min，42℃水浴放置90 s，取出后立即冰浴2 min，加入不含抗生素的LB液体培养基800 μl，置37℃摇床振摇2 h，取200 μl菌液用灭菌的弯头玻棒均匀涂布于LB平板固体培养基表面(含氨苄青霉素100 mg/L)，37℃倒置平板孵育过夜。

　　1.2.5 阳性重组质粒的筛选与鉴定 接种环随机挑取转化后生长出的菌落，接种3 ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100 mg/L)，置37℃摇床振摇过夜，次日提取质粒DNA并电泳，取大小为空载体加目的基因的质粒作酶切鉴定，反应条件同前。

　　1.2.6 测序 取经酶切鉴定含有目的基因的重组质粒送测序。DNA序列测定由上海生工公司完成。

　　2 结果

　　2.1 SLC34A2基因的RT-PCR 以抽提的肺组织的RNA为模板，用特异性引物PCR扩增SLC34A2基因，2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约2 000 bp位置可见一清晰的条带(图1)，扩增到了与预期片段大小(2 073 bp) 相符的基因片段。

　　2.2 重组质粒pcDNA3.1 (+) -SLC34A2的双酶切鉴定 重组质粒pcDNA3.1 (+) - SLC34A2 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，可切出2个片段，大片段迁移率与空质粒双酶切后的片段一致，约为5 428 bp;小片段迁移率与PCR 产物一致，约为2 073 bp，与预期值相符合，见图2。

　　2.3 pcDNA3.1(+)-SLC34A2 重组质粒PCR鉴定 以pcDNA3.1(+)-SLC34A2重组质粒为模板，用P1、P2 引物对其进行PCR扩增，PCR 产物于2%的琼脂糖凝胶电泳(图2) ,结果显示约2 073 bp 处有一明显亮带。

　　2.4 pcDNA3.1(+)-SLC34A2重组载体测序及序列分析 DNA 测序结果显示，重组质粒含有2073 bp 的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序结果见图3(显示部分)。

　　1、SLC34A2 基因PCR 产物;M：Marker Ⅳ

　　图1 SLC34A2基因的PCR扩增结果(略)

　　1、pcDNA3.1(+)-SLC34A2重组质粒PCR 产物;2、经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pcDNA3.1(+)-SLC34A2;M：Marker Ⅳ

　　图2 pcDNA3.1 (+)-SLC34A2酶切、PCR鉴定结果(略)

　　图3 SLC34A2 基因测序结果(显示部分1-600 bp)(略)

　　3 讨论

　　肺泡微石症(pulmonary alveolar microlithiasis，PAM)是一种原因未明的两肺肺泡内存在微小结石的少见疾病，治疗上目前没有有效的手段。相关的研究显示，基因SLC34A2(编码磷酸钠协同转运蛋白)突变可能导致了PAM的发生〔2〕，同时在睾丸微石症患者中也检测到了该基因的突变，提示该基因的突变可能与某些钙、磷代谢性疾病相关。

　　SLC34是一个溶解物携带家族，包括NaPi-Ⅱa (SLC34A1)，NaPi-Ⅱb (SLC34A2)和NaPi-Ⅱc (SLC34A3)，主要参与维持机体内环境无机物的平衡〔3〕。NaPi-Ⅱb (SLC34A2)编码的蛋白质为磷酸钠协同转运蛋白，主要参与无机磷的代谢。在大鼠胚胎16.5天直到成熟的肺均可检测到NaPi-Ⅱb前蛋白，原位杂交显示NaPi-Ⅱb表达在2型肺泡细胞，这提示其与肺泡表面活性物质合成相关，并随着肺的发育而变化。在2型上皮细胞中磷酸盐可能是磷酸脂(肺泡表面活性成分)的重要组成成分。如果NaPi-Ⅱb在表面活性物质合成收集磷酸盐的过程中扮演重要角色，那其表达不仅存在于细支气管上皮。NaPi-Ⅱb可能成为2型肺泡上皮细胞的标志物，对肺癌的发生可能也有一定帮助〔4〕。2006年Corut等首先通过纯合子基因定位将PAM的候选致病基因定位在4P15，指出SLC34A2基因突变可能导致了PAM的发生。我们目前已经清楚PAM患者肺泡内微小结石的主要成分是钙和磷，由此可见该基因在肺泡内的钙和磷代谢中发挥着重要作用〔2〕。

　　进一步研究发现，该基因不仅在肺泡上皮细胞中发挥重要的作用，在肠道内无机磷的代谢主要依靠基因SLC34A2。SLC34A2 mRNA的表达沿着小肠的 A-P轴明显增加，表达最多在回肠，SLC34A2 mRNA专门表达在小肠绒毛上皮细胞〔5〕。大鼠的肝细胞和胆管细胞的胆汁中磷(Pi)的重吸收也主要依靠NaPi-Ⅱb完成。由NaPi-Ⅱb导致的小管内Pi重吸收可有助于防止胆汁中Pi丢失，保持肝细胞和胆管细胞中Pi的浓度。在大鼠的胆汁中Pi浓度与血浆中相比低200倍，这说明，NaPi-Ⅱb在胆管中清除胆汁中的Pi，防止形成沉淀〔6〕。事实上，胆结石的各种结石其核心成分是磷酸钙，推测磷酸钙的形成加速了结石的形成，因此NaPi-Ⅱb的存在可防止结石形成。

　　以上的研究表明，基因SLC34A2在呼吸系统、消化系统及泌尿系统的钙、磷代谢中发挥重要的作用。该基因的突变可能是各类结石形成的一个因素。本研究从正常新鲜的肺组织中，通过RT-PCR方法获得该基因完整的cDNA序列，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中，构建重组体pcDNA3.1(+)-SLC34A2，并通过酶切分析，PCR及测序鉴定，得到了阳性重组体。

　　本研究用于构建真核表达重组载体的质粒pcDNA3.1(+)是带有巨细胞病毒(CMV) 强启动子的真核表达载体，可使外源基因在哺乳动物细胞中高效表达，还含有供目的基因插入的多克隆位点和牛生长激素(BGH) 基因的加尾信号，同时pcDNA3.1 (+) 携带氨苄青霉素和新霉素的抗性基因，可用于转化和转染后阳性克隆的筛选。因此本研究构建的pcDNA3.1(+)-SLC34A2真核表达载体，为研究上述疾病病因，研究该基因在钙、磷代谢中的功能，最终为治疗上述疾病，奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1 Hu Q，Izumi S，Miyazawa H,et al.Mutations in the SLC34A2 gene are associated with pulmonary alveolar microlithiasis〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007;175(3)：263-8.

　　2 Corut A，Senyigit A，Uqur SA,et al.Mutations in SLC34A2 cause pulmonary alveolar microlithiasis and are possibly associated with testicular microlithiasis〔J〕.Am J Hum Genet，2006;79(4):650-6.

　　3 Forster IC，Hernando N，Biber J,et al.Proximal tubular handling of phosphate：A molecular perspective〔J〕.Kidney Int，2006;70(9):1548-59.

　　4 Hashimoto M，Wang DY，Kamo T,et al.Isolation and localization of type Ⅱb Na/Pi cotransporter in the developing rat lung〔J〕.Am J Pathol，2000;157(1)：21-7.

　　5 Anderle P，Sengstag T，Mutch DM,et al.Changes in the transcriptional profile of transporters in the intestine along the anterior-posterior and crypt-villus axes〔J〕.BMC Genomics，2005;6(1)：69.

　　6 Frei P，Gao B，Hagenbuch B,et al.Identification and localization of sodium-phosphate cotransporters in hepatocytes and cholangiocytes of rat liver〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005;288(4):G771-8.