胰岛素样生长因子结合蛋白-3对非小细胞肺癌的作用

　　作者：皮佳俐 徐平 宋卫东 刘媛媛 朱棠 作者单位：北京大学深圳医院呼吸内科，广东 深圳 518036

　　【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)诱导非小细胞肺癌细胞(NSCLC)凋亡、抑制增殖的作用。方法 分别应用CCK-8法、流式细胞仪检测IGFBP-3对NCI-H520、A549细胞株体外增殖、细胞周期及调亡的作用，用倒置显微镜观察细胞形态学变化。结果 CCK-8实验表明：浓度0.05,0.1，0.2，0.4,0.8 μg/ml 的IGFBP-3对NCI-H520、A549增殖有明显的抑制作用，且表现为剂量依赖性;流式细胞学显示：两株细胞在IGFBP-3作用后均出现凋亡峰，且S期的细胞减少，以A549更为明显，倒置显微镜下可见胞质浓缩、体积缩小，细胞碎裂。结论 IGFBP-3可抑制NSCLC增殖，诱导凋亡。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;胰岛素样生长因子结合蛋白-3;凋亡;增殖

　　基金项目：广东省医学科研基金(编号：A2006606)

　　Effect of insulin like growth factor binding protein 3 on non-small cell lung cancer

　　PI Jia-Li, XU Ping, SONG Wei-Dong, et al.

　　Department of Respiration of Beijing University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518034, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)-3 on inducing apoptosis and inhibiting proliferation of human non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods The inhibitory effect of IGFBP-3 on proliferation of NCI-H520 and A549 cell lines in vitro was detected by CCK-8 assay.The cell cycle arrest and apoptosis were observed by flow cytometry. The morphological change was observed by inverted microscope. Results CCK-8 assay showed that IGFBP-3 at the concentration of 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.80 μg/ml significantly inhibited proliferation of A549 and NCI-H520 cells in a dose dependent.Flow cytometry analysis showed that IGFBP-3 induced S phage arrest and high peak of cell apoptosis of A549 and NCI-H520 cells, especially in A549. Under inverted microscope, some A549 and NCI-H520 cells with condensed cytoplasm, loss of volume and broken cell were seen. Conclusions IGFBP-3 could inhibit proliferation, and induce apoptosis of NSCLC cells.

　　【Key words】 Non-small cell lung cancer;Insulin-like growth factor binding protein 3; Apoptosis; Proliferation

　　肺癌的发病率呈逐年上升趋势。尽管新的化疗药物不断问世，但经手术、放疗和化疗在内的综合治疗后，其效果仍不理想，总的5年生存率美国在15%以下，我国则更低。肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失控的结果，也是细胞周期失控的结果。生长激素-胰岛素样生长因子轴在调控细胞生长及凋亡过程中发挥极其重要的作用〔1〕。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)作为血清中含量最丰富的IGFBPs，可通过胰岛素样生长因子1(IGF-1)依赖及IGF-1非依赖方式调节细胞增殖和凋亡。最近的研究发现IGFBP-3与肿瘤密切相关，具有促凋亡、抑制细胞生长等作用〔2〕。利用原核表达载体体外表达大量的IGFBP-3将为研究其对肺癌细胞的生物学作用打下良好的基础，并使其临床应用成为可能。本研究旨在观察不同浓度IGFBP-3对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株的体外增殖的抑制作用和诱导凋亡作用，为NSCLC新的治疗方法提供实验室依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验试剂 人重组IGFBP-3购自美国Peprotech Asia公司、Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自碧云天生物技术研究所，PRMI 1640培养基和胎牛血清购自Hyclone公司，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司。

　　1.2 细胞系及细胞培养 人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌细胞A549购自上海拜力生物科技有限公司。培养液为含10%胎牛血清的PRIM 1640培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 CCK-8法实验 将处于对数生长期的NCI-H520与A549接种于96孔培养板，每孔200 μl。第2天加入终浓度分别为：0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/ml的IGFBP-3，以未加IGFBP-3处理的细胞为对照孔。空白对照孔只加PRMI 1640培养液。继续培养48 h后，每孔加入20 μl CCK-8，继续培养2 h后，在酶标仪(Model 680，Bio Mad)上测定各孔450nm波长的OD值,以上实验重复3次。计算出抑制率。抑制率计算公式为：(对照孔的OD值-实验孔的OD值)/对照孔 OD值×100%。

　　1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分析 接种对数生长期的各组细胞于25cm培养瓶中，第2天于实验组中加0.2 μg/ml的 IGFBP-3，作用2 d后收集各组细胞，预处理后加入1 ml PI(5 ng/ml)染液染色20～30 min，避光放置30 min待测。全部数据经流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)，PI为荧光2，获得的数据用CELLQuest 软件分析。

　　1.3.3 细胞凋亡形态学观察 将NCI-H520和A549分别接种于6孔板中，加入PRIM 1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，第2天待细胞贴壁后分别加入0.2 μg/ml的IGFBP-3，以未加IGFBP-3的细胞作为对照。IGFBP-3作用3 d后在倒置相差显微镜(Olympus)下观察细胞加药前后形态变化。

　　1.4 统计学处理 用SPSS11.5统计软件分析数据，采用独立样本t检验进行统计分析。

　　2 结果

　　2.1 CCK-8法检测IGFBP-3对NCI-H520与A549细胞株增殖的影响 将两株细胞用不同浓度IGFBP-3处理48 h后，与正常对照组相比，0.1 μg/ml组与0.2 μg/ml组NCI-H520细胞抑制率明显升高(P<0.05),而IGFBP-3 0.4 μg/ml与0.8 μg/ml组NCI-H520细胞及IGFBP-3所有浓度组A549细胞抑制率升高更多，提示IGFBP-3对肺癌细胞有生长抑制作用，且呈一定的剂量依赖性，IGFBP-3对A549的杀伤作用较NCI-H520强(见表1)。

　　2.2 细胞凋亡形态学观察 0.2 μg/ml IGFBP-3作用3 d，绝大部分A549细胞核染色质浓缩，细胞碎裂，NCI-H520细胞胞质浓缩、体积缩小，部分细胞碎裂(见图1)。

　　2.3 IGFBP-3对NCI-H520与A549细胞周期和细胞凋亡的影响 流式细胞术结果表明IGFBP-3作用前，两株细胞S期分别为23.7%、25.5%。在IGFBP-3作用后，S期分别为16.6%、22.9%，均较前下降(P<0.01，P<0.05)，以A549更为显著。两株细胞在IGFBP-3作用后G峰前均出现凋亡细胞所特有的细胞凋亡峰(图2)。

　　表1 不同浓度IGFBP-3对两种肺癌细胞抑制率的比较(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

　　A549对照组 A549，0.2 μg/ml IGFBP-3组 NCI-H520对照组 NCI-H520 0.2 μg/ml IGFBP-3组

　　图1 细胞凋亡形态学观察(×200)(略)

　　未经处理的A549 IGFBP-3作用的A549 未经处理的NCI-H520 IGFBP-3作用的NCI-H520

　　图2 IGFBP-3对NCI-H520，A549细胞凋亡的影响(略)

　　3 讨论

　　随着肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学以及分子生物学技术的发展,肿瘤生物治疗不断被赋予新的内容,其涵盖的范围已从经典的免疫治疗或生物反应调节(BRM)治疗,扩展到基因治疗以及近年来兴起的分子靶向治疗。肿瘤生物治疗显示出较好的发展前景，为当前研究热点之一。自1957年Salmon和Daughaday在研究生长激素作用时首次发现IGF-1以来，人们对胰岛素样生长因子轴进行了深入广泛的研究，IGF在肿瘤发生中的作用越来越受关注〔1〕。IGFBP-3是血液中主要的IGF-1结合蛋白，可通过IGF-1依赖与非依赖的方式对多种细胞起到抑制增殖，促进凋亡作用〔3～5〕。在体外用IGFBP-3 cDNA转染人肺癌、乳腺癌、前列腺癌以及结肠癌细胞株〔6～9〕，这些肿瘤细胞的增殖减慢，并且出现明显的细胞凋亡。还有研究发现在IGFBP-3的基因中共有3个P53的结合位点〔10，11〕，P53是体内重要的抑瘤基因，IGFBP-3还可以通过P53而发挥促细胞凋亡作用。同时，实验证实IGFBP-3可不依赖P53而发挥抗凋亡作用〔7〕。所以，IGFBP-3可以通过多种途径抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。人工重组表达的IGFBP-3将NSCLC的治疗提供了新的希望。

　　肺癌是最常见且死亡率最高的恶性肿瘤，其中大约75%～80%是NSCLC。本研究提示IGFBP-3对体外培养的肺腺癌细胞株A549及肺鳞癌细胞株NCI-H520具有明显的抑制增殖作用，且呈一定的剂量依赖性，表明一定浓度范围内，IGFBP-3对部分的NSCLC细胞具有一定的杀伤力。结合细胞凋亡的形态学观察与流式细胞仪结果，认为该作用与其能诱导细胞凋亡与坏死有关。肺腺癌细胞株对该作用更敏感。

　　研究发现当肿瘤细胞阻滞于G2期和M期时，对放射线的敏感性增加〔12〕，当肿瘤细胞大部分同步在G2和M期时，较小的剂量即可引起细胞死亡或染色体畸变，最大限度地杀伤肿瘤细胞，对正常组织的损伤最少。本研究表明：IGFBP-3使细胞株A549及NCI-H520细胞S期(DNA合成期)比例明显下降，G2/M期比例增加，而G1期无明显变化。我们认为IGFBP-3通过抑制肺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、增加肿瘤细胞对放疗的敏感性等多种机制发挥对NSCLC的抑制作用，因此IGFBP-3在抗肿瘤方面有极大的潜能，有可能成为临床肺癌化疗新药物。

　　【参考文献】

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