内皮素-1在肺癌中的表达及其与血管生成的关系

　　作者：刘甡 江晶 王春玲 作者单位：佳木斯大学第一附属医院呼吸内科，黑龙江 佳木斯 154002

　　【摘要】 目的 了解内皮素-1(ET-1)在肺癌组织标本中的表达并定量分析其与肺癌分型、分级的关系，观察ET-1的表达与肿瘤微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的关系，探讨ET-1在肿瘤血管生成中的作用。方法 用免疫组织化学SABC染色方法检测ET-1及VEGF在肺癌中的表达、MVD的计数，并用图像分析技术测定ET-1的含量。结果 ET-1主要分布在肿瘤细胞的胞浆中，在鳞癌、腺癌等非小细胞肺癌中高表达，而在小细胞肺癌中的阳性表达率低。图像分析表明，鳞癌、腺癌的分化程度越低ET-1含量越高，分化程度越高ET-1含量越低。ET-1表达阳性组中MVD显著增高，且ET-1的表达与VEGF有关。结论 ET-1存在于肺癌细胞中，在腺癌和鳞癌组织中高表达，且ET-1含量与肿瘤分化程度有一定关系。ET-1可能作为一种血管生成促进因子参与肺癌的血管形成。

　　【关键词】 肺癌;内皮素;血管形成;免疫组化

　　内皮素-1(ET-1)在肿瘤血管形成过程中的作用日益引起广泛的重视。ET-1可通过旁分泌的方式直接及间接的促进肿瘤中血管的生成。有研究证实ET-1在肺癌组织中高表达并参与诱导肺癌细胞的增殖〔1〕。本实验采用免疫组织化学SABC方法及图象分析技术，检测肺癌组织中ET-1的阳性表达及其与微血管密度的关系，以探讨ET-1与肺癌的生长和转移的关系，为临床应用提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 研究对象 所有对象均来自2004年1月～2006年12月我院经手术或纤支镜检查获得的肺组织石蜡标本。分3组:(1)肺癌组:共40例，年龄28～72(平均52.6)岁;男21例，女19例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗，所有标本均重新切片后经HE染色证实为肺癌。组织学分类参照WHO (1981年)标准，其中鳞癌21例，腺癌14例，小细胞未分化癌5例;高分化20例，中分化7例，低分化8例;非小细胞肺癌依照1997年国际抗癌联盟〔MCC〕修订的标准进行临床分期，其中Ⅰ期+Ⅱ期21例，Ⅲ期+Ⅳ期14例。(2)肺良性病组:共12例，男9例，女3例;年龄28～70(平均49.8)岁。标本重新切片后经HE染色证实7例为结核球、5例为肺炎。(3)正常对照组:共10例，男6例，女4例;年龄34～68(平均47.6)岁。10例正常对照组标本来源于行肺叶切除术的肺组织中远离病变的正常肺组织，经HE染色证实为正常肺组织。

　　1.1.2 试剂与药品 主要购自武汉博士德生物工程有限公司：(1)兔抗人内皮素多克隆抗体(即用型);(2)兔抗人血管内皮生长因子多克隆抗体〔即用型〕;(3)兔抗人第8因子相关抗原多克隆抗体〔即用型〕;(4) HIGH-SABC试剂盒:正常山羊血清封闭液、生物素标记的二抗山羊抗兔IgG、HIGH-SABC〔链酶亲和素-过氧化物酶复合物〕、复合消化液及抗原修复液。

　　1.2 方法 采用SABC免疫组织化学染色法。所有石蜡标本均行5 μm切片，连续切4片，置60℃烤箱内烤30 min。所有切片分别经二甲苯脱蜡，无水乙醇及其他不同浓度乙醇脱苯，自来水洗2 min水化。一张切片行HE染色核实病理诊断，其余切片行SABC染色，按药盒操作规程进行。以PBS代替一抗作阴性对照，用武汉博士德生物工程有限公司提供的已知阳性切片作阳性对照。

　　1.3 结果判定

　　1.3.1 ET-1、血管内皮生长因子(VEGF)表达的判定标准 采用SABC免疫组化染色法，镜下观察细胞浆呈棕黄色颗粒状，切片中观察5个高倍视野(200×)，每一视野记数100个细胞，阳性染色细胞<5%为阴性，≥ 5%为阳性。

　　1.3.2 肿瘤微血管密度(MVD)的测定 参考Weidner方法先在低倍镜(40×)下扫视整个切片，确定对FⅧRAg明显着色(棕褐色)微血管密度最高区，即所谓热点区。然后换成高倍镜(200×)进行记数。凡在肿瘤组织中与邻近微血管、肿瘤细胞及其他结缔组织分界清楚的任何一个染成棕褐色的细胞或细胞簇均被认为是一个血管;只要结构不相连，其分枝结构也算作一个血管。但不能用有无红细胞的出现及是否形成管腔来记数血管数。已形成明显肌层的血管不参与计数，结果以3个视野血管的均数表示。

　　1.4 统计学处理 计量资料数据采用x±s表示，所得数据采用t检验和方差分析;计数资料采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 不同肺组织中MVD、VEGF和ET-1表达分布情况 MVD阳性染色局限于血管内皮细胞膜，呈棕黄色，形成条状(纵切面)或环状(横切面)血管结构。微血管形态不规则，有些已成管腔结构，有些只见内皮细胞呈点状分布。微血管在癌组织中的分布呈异质性，大多集中在肿瘤边缘，癌巢及癌细胞密集区MVD显著少于癌周区域及增生活跃区域。肺癌组织中MVD显著高于肺良性病变组及正常对照组(P<0.01);而肺良性病变组及正常对照组的MVD差异无显著性(P>0.05)。见表1。

　　VEGF阳性着色为棕黄色颗粒，主要分布于肿瘤细胞浆中，在肿瘤细胞坏死灶周围尤为明显。阳性肿瘤组织内及邻近基质组织内的血管也有着色。肺癌组织中VEGF阳性率为62.50%(25/40)，显著高于肺良性病变组(16.67%)及正常对照组，P<0.01;肺良性病变组及正常对照组的VEGF阳性率差异无显著性，P>0.05。见表1。

　　ET-1着色主要分布于肿瘤细胞浆中，表现为黄色或棕褐色颗粒。阳性肿瘤组织及其邻近基质组织中血管内皮细胞和成纤维细胞也有不同程度的着色。肺癌组织中ET-1阳性率为42.50%(17/40)，显著高于肺良性病变组(8.33%)及正常对照组，P<0.05;肺良性病变组及正常对照组的ET-1阳性率差异无显著性，P>0.05。见表1。

　　2.2 非小细胞肺癌中MVD、VEGF和ET-1表达与临床病理之间的关系 MVD与原发肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移有关，差异有显著性(P<0.01);而与病理分型无明显关系P>0.05。VEGF表达与肿瘤大小、淋巴结转移有关，肿瘤直径>5 cm组VEGF阳性率为87.50%(14/16)，与肿瘤直径≤5 cm组(52.63%)相比差异有显著性，P<0.05;淋巴结转移组VEGF阳性率为92.31%(12/13)，与无淋巴结转移组(54.55%)相比差异有显著性，P<0.05;而VEGF与组织学分级、病理分型无明显关系，P>0.05。ET-1与肺癌原发肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级有密切关系P<0.05，而与病理分型无明显关系(P>0.05)。见表2。

　　表1 ET-1、MVD和VEGF在不同组织中表达情况(略)

　　与肺癌组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

　　表2 ET-1、MVD和VEGF表达与临床病理的关系(略)

　　组内比较：1)P<0.01，2)P<0.05

　　2.3 肺癌组中ET-1表达与MVD的关系 ET-1阳性组MVD为25.18±4.81，明显高于ET-1阴性组，差异有显著性(P<0.01)，并且在VEGF和ET-1表达均阳性的癌组织中，连续切片显示VEGF表达阳性的区域ET-1也倾向于阳性。

　　2.4 ET-1定量图像分析 应用BI2000医学图像分析系统对17例ET-1阳性表达的肺癌切片行单位面积平均A值的定量分析，结果显示：鳞癌、腺癌含量分别为0.158±0.054和0.173±0.045，两组相比差异无显著性(P>0.05)。

　　鳞癌与腺癌组织分化程度越低，ET-1含量越高。鳞癌高分化、中分化、低分化切片单位面积平均A值分别为0.103±0.032、0.147±0.015、0.208±0.038;腺癌高分化、中分化、低分化切片单位面积平均A值分别为0.125±0.007、0.160±0.014、0.213±0.031。其中低分化与中分化、高分化比较差异有显著性(P<0.01)，中分化与高分化比较差异有显著性(P<0.05);而鳞癌与腺癌两组间的各分级之间比较差异无显著性(P>0.05)。

　　3 讨论

　　恶性肿瘤的无限侵袭性生长及其转移依赖于血管生成，这些新生成的血管将还在生长的肿瘤和循环系统直接连接起来，使其供给肿瘤生长需要的物质。此外，肿瘤还可利用新生血管作为转移的方式和途径，血管新生是肿瘤生长与发展的必经之路，与实体瘤的发生和转移有着密切的关系〔2〕。随着肿瘤微血管密度(MVD)的增加，肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增加。本试验结果显示肺癌组织中MVD显著高于肺良性病变组和正常对照组,且与肺癌原发肿瘤大小(T)、淋巴结转移状态(N)和细胞分化程度有密切关系。肿瘤的血管生成是一个极其复杂过程，受多种正负血管生成因子的调控，血管内皮生长因子(VEGF)是研究最深入的血管生成因子。在肺癌等多种实体瘤(如消化系统、神经系统、泌尿、生殖系统肿瘤)组织中均有VEGF及其受体的表达，且与肿瘤血管计数有关，可作为肿瘤转移的临床监测指标〔3〕。本实验结果显示，肺癌组中VEGF的表达显著高于良性病变组及正常对照组，在非小细胞肺癌中VEGF与原发肿瘤大小、淋巴结转移状态有关。随着肿瘤VEGF表达增加，MVD明显增加，肺癌瘤体的体积明显增大，淋巴结转移明显增多。

　　ET-1是由血管内皮细胞产生的一种缩血管多肽〔4〕，可作为肿瘤细胞自分泌因子，通过与ET-1受体结合促进肿瘤细胞增殖。ET-1主要定位于肿瘤组织内血管、成纤维细胞和神经纤维，ET-1可能参与肿瘤中血管的形成。本实验检测ET-1在肺癌组织中的阳性表达与分布，应用图像分析技术做ET-1定量分析，并观察ET-1在肺癌血管形成的作用。结果表明ET-1主要分布于肿瘤细胞胞浆中，肺癌组ET-1阳性表达率明显高于良性病变组及正常对照组。在17例阳性表达的肺癌中，均为鳞癌和腺癌，5例小细胞肺癌的ET-1表达均为阴性，小细胞肺癌与非小细胞肺癌的ET-1表达差异有显著意义。对17例ET-1阳性表达者行图像分析进行ET-1含量的定量测定,结果表明，鳞癌与腺癌的 ET-1含量差异无显著性。肿瘤组织分化程度越高，ET-1定量越低;而分化程度越低，ET-1定量越高，说明肿瘤分化程度高低与ET-1含量有一定关系。恶性程度越高的肿瘤细胞生长增殖越旺盛，ET-1含量也越高，反之，恶性程度越低的肿瘤细胞ET-1含量也越低。本实验结果表明，ET-1阳性组其MVD明显增高，且ET-1除在肿瘤细胞胞浆有强表达外，在肿瘤组织血管及成纤维细胞也有较强表达，而ET-1表达阴性的肿瘤组织中血管内皮细胞仅有较弱的表达，这种定位特征提示肿瘤细胞分泌的ET-1积聚在靶细胞上，对血管内皮细胞起调节作用，因此ET-1参与肺癌的血管生成。ET-1参与肿瘤血管形成的机理，可能是由于在恶性肿瘤生长过程中，由于肿瘤细胞生长过快必然会造成组织严重缺氧，因而触发了代偿性的血管再生〔5〕。缺氧可通过缺氧诱导因子-1(HIF-1)的介导，刺激前ET-1原启动子的活性增加，促进肿瘤细胞合成、释放ET-1，然后通过旁分泌作用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞上的ET受体，刺激内皮细胞和平滑肌细胞的增生。ET-1还可诱导内皮细胞释放的间质金属蛋白酶-2(MMP-2)显著增加，有利于细胞外基质的降解，增加内皮细胞的迁移及侵袭能力〔6〕。ET-1在肿瘤坏死因子α(TNF-α)的协助下，通过ETBR还可诱导人血管内皮细胞表面上血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)的表达〔7〕。VCAM-1是一种白细胞选择性黏附因子，在内皮细胞的迁移和毛细血管形成过程中，参与内皮细胞间的连接和内皮细胞对细胞外基质的黏附，有利于血管的生成。ET-1还可诱导内皮细胞的形态发生改变，如细胞伸长、促使相邻的细胞排列成直线，形成血管条索样结构。可见ET-1对内皮细胞的作用既包括早期(细胞增殖、游走和MMP-2产量增加)也包括晚期(分化成血管条索)的血管发生。值得注意的是，在ET-1和VEGF均有表达的13例肺癌组织中，连续切片显示ET-1表达阳性区域，VEGF表达也倾向呈阳性，在两者皆阳性的癌组织中MVD高于VEGF或ET-1阳性病例，推测ET-1与VEGF可能具有协同作用。

　　综上所述，ET-1在促进非小细胞肺癌血管生成的过程中发挥重要作用，可作为评估非小细胞肺癌生长的一个监测指标，为判断非小细胞肺癌分化程度和治疗转归提供一定的客观依据。ET-1的表达与VEGF有关，可能对VEGF有上调作用，二者相互协同，共同调节和诱导肺癌微血管的形成。

　　【参考文献】

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