IL17 在沙眼衣原体呼吸道感染中的早期表达及其与机体防御关系

　　作者：张效云 徐志伟 高丽芬 陈丽丽 钟光明 作者单位：(1.河北北方学院医学技术学院生物化学教研室，河北 张家口 075000;

　　【摘要】 目的:探讨炎症性细胞因子IL17在沙眼衣原体呼吸道感染中的早期表达及与机体防御的关系。方法:用沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn)通过鼻腔感染小鼠，用IFA检测衣原体在肺组织的生长;通过ELISA检测小鼠肺组织IL17、IL6、IL8、TNFα、IL1α和IL1β等炎症性细胞因子表达。结果:MoPn感染后第1天，肺组织有衣原体生长，于感染后第8天达高峰;感染后第2天，IL17在小鼠肺组织中的表达达峰值，并很快下降;TNFα、IL1α、IL1β和IL6在感染后第3天达到峰值，而IL8则在第8天出现高峰。结论:IL17在衣原体肺炎早期出现，能提高局部IL6，IL8,TNFα,IL1α,IL1β的表达。这些结果显示IL17早期表达可能作为固有免疫反应成分在起动宿主抵御细胞内病原体感染中发挥重要的作用。

　　【关键词】 衣原体/沙眼;IL17;呼吸道感染;小鼠

　　The Early IL17 Expression in Chlamydia Trachomatis Respiratory

　　Infection and Its Relationship with Immune Defence

　　ZHANG Xiaoyun1,XU Zhiwei1,GAO Lifen2,et al

　　1.Department of Biochemistry,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China;

　　2.Department of Microbiology and Immunology,University of Texas Health Science Center at San Antonio,

　　7703 Floyd Curl Drive,San Antonio,78229,Texas，USA

　　【ABSTRACT】 Objective:To evaluate the early IL17 expression in Chlamydia trachomatis respiratory infection and its relationship with immune defence. Methods:A murine model of pneumonia induced by intranasal inoculation with Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis(MoPn,now classified as a new species C.muridarum)biovar was used for the study. Chlamydial growth in the lung was assessed by inoculating HeLa cell monolayer with lung homogenates followed by IFA. IL17 and other cytokines such as TNFα,IL6,IL8,IL1αand IL1βwere measured by ELISA. Results:Chlamydial growth in the lung was found on the 1st day after infection,and reached its peak on the 8th day with subsequent decline in quantity. IL17 peaked at 48h while other cytokines peaked on the 3rd day(e.g. TNFα,IL6,IL1αand IL1β)or later(IL8). Conclusion:IL17 is produced early in airway upon Chlamydia trachomatis,it can enhance high production of TNFα,IL6,IL8,IL1αand IL1β in the lung. These suggest that an early IL17 response as an innate immunity component should play an important role in initiating host defense against infection with Chlamydia trachomatis in the airway.

　　【KEY WORDS】 Chlamydia Trachomatis,IL17,Respiratory Tract Infections,Mice

　　沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)是一类严格细胞内寄生的病原体，能引起多种人类和动物疾病，包括沙眼、生殖道感染、不孕不育和肺炎等,对人类的危害性很大。小鼠模型研究表明，CD4+Th细胞(Th1而非Th2)和依赖IFNγ的免疫反应是宿主控制衣原体感染的主要保护性因素[1]，抗体和CD8T细胞也可能在宿主抵御衣原体感染中发挥作用[2]。然而，Th17细胞和其分泌的细胞因子IL17在沙眼衣原体感染中的作用尚不清楚。

　　初始CD4+T细胞可被诱导从而表达转录因子RORγt，并分泌细胞因子IL17，分化成为除了Th1细胞和Th2细胞之外的一种新的Th细胞亚型Th17[3]。IL17家族包括IL17(IL17A),IL17BF。IL17和IL17F主要由活化的CD4+T细胞产生，参与宿主固有免疫应答如中性粒细胞募集及活化[4]。IL17可在不同的组织诱导前炎症反应或抗炎症反应，诱导IL6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)和细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM 1)的产生[5,6]，另一方面，IL17 也能阻止肿瘤坏死因子(TNFa)诱导的趋化因子RANTES和干扰素诱导蛋白10(IP10)的分泌[7,8]。IL17做为前炎症因子在许多疾病中发挥作用,例如，用抗IL17单克隆抗体处理的小鼠能抑制中枢神经系统的自身免疫性疾病[9]。缺乏产生Th17细胞的小鼠能抵抗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、胶原蛋白诱导的关节炎和炎症性肠病(IBD)[9,10]。本研究以鼠衣原体肺炎为模型，研究衣原体感染不同时间IL17的表达，发现IL17在感染衣原体后在固有性免疫应答早期阶段短暂表达，随后很快下降，但其他细胞因子IL6,IL8,TNFα,IL1α,IL1β则分别在第3天或第8天出现高峰，基于这些资料我们认为IL17在衣原体肺炎早期出现，能提高局部IL6,IL8,TNFα,IL1α,IL1β的表达，从而提高机体抗感染固有免疫应答能力。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 主要试剂:IL17试剂盒与其他细胞因子的试剂盒均购自R&D systems 公司,组织匀浆器购自Fisher Scientific公司，Hoechst染料购自Invitrogen。Cy2标记羊抗兔IgG(绿)和Cy3标记羊抗鼠(红)购自Jackson免疫制剂公司(PA,USA)。

　　主要仪器:CO2培养箱(Formo,USA);荧光生物显微镜(AX270 equipped with a CCD camera,Olympus,Japan);酶标仪(Molecular Devices Corporation,USA)。

　　1.2 沙眼衣原体株 沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn,由Dr.ZHONG实验室提供)生长于HeLa 229细胞,用不连续密度梯度离心法纯化衣原体原体(EB),进行活性测定后用于感染小鼠，具体方法参见文献[11]。

　　1.3 实验动物及感染 8～9周龄雄性或雌性C57BL/6小鼠,体重18～20g，均购自Jackson laboratories,Bar Harbor,Maine。随机分组,每组6～8只，依不同处死时间点，分为8个研究组及相应的8个对照组。标记动物,分笼颗粒饲料饲养,温度18～24℃,光暗周期12h。自由饮水进食。研究组在微麻状态下鼻腔内吸入40μL含4×103MoPn包涵体形成单位(IFU)的SPG(蔗糖磷酸盐缓冲液),对照组吸入等量SPG。在感染后不同时间处死研究组小鼠及相应对照组小鼠。

　　1.4 肺组织匀浆制备 无菌采集小鼠全肺,在冰上用2mL玻璃研磨器加入1.5mL SPG制备成组织匀浆，经超声后，在4℃，6000rpm/min离心15min,上清液用来进行IFU计数和细胞因子的测定。

　　1.5 衣原体活性测定 选取消毒灭菌后盖玻片放入24孔培养板内,收获培养24h左右的Hela细胞，经胰蛋白酶消化、记数后，用含10%FBS的DMEM稀释至8×104/mL,每孔加1mL,37℃及5%CO2条件下培养过夜。将生长在盖玻片上的单层Hela细胞，移去培养基,用DMEM洗一次，加入0.5mL 30μg/mL的DEAE葡聚糖,37℃10min。弃掉DEAE,加入适当稀释的肺组织匀浆上清液,每孔200μL,室温下1000rpm/min离心1h,吸去上清液，加入含有2μg/mL放线菌酮(cycloheximide)、10μg/mL庆大霉素及100mL/L FBS的DMEM,每孔1mL,37℃5% CO2条件下培养22h。吸掉培养基,用1×PBS洗一次,加入含有2%PF的1×PBS0.5mL,室温固定30min,然后加入含有2%Sapornin的0.05%PBST室温1h。吸掉孔内液体,加入含10%FBS的DMEM0.5mL，37℃封闭1h。吸掉孔内液体加入一抗(含10%FBS的DMEM10mL,R@CT395 5μL,MB5H9 100μL,由Dr.ZHONG实验室提供)，37℃作用1h。用1×PBS洗3次,每次放置5min，最后风干。加入20μL二抗(1mL 10%FBS DMEM,5μL G@RIgGCy2,5μL G@M IgGCy3,2μL hoechst),37℃作用1h。用1×PBS洗3次每次放置5min，然后封片,在荧光显微镜下计数包涵体个数以IFU表示。每个盖玻片随机计数5个视野，若视野不足1个IFU的，计数整个盖玻片,呈明显细胞毒性的细胞不在计数之内。每个器官的总IFUs计数为每个视野的IFUs,每个盖玻片的计数视野，肺组织上清液的稀释倍数和总体积的综合计数。

　　1.6 统计分析

　　结果用均数±标准差(x±s)表示，组间差异用t检验。

　　2 结果

　　2.1 衣原体在小鼠肺组织的生长 用小鼠肺组织匀浆做衣原体活性测定,于感染后第1天，Hela细胞内可见有衣原体包涵体生长，IFU数值随着感染进程持续增高，于感染后第8天IFU达峰值,以后逐渐下降(图1)。

　　图1 MoPn呼吸道感染小鼠肺组织IFU生长计数2.2 衣原体MoPn肺感染早期诱导IL17的表达 用小鼠肺组织匀浆进行IL17 ELISA测定，发现IL17表达在感染48h后达到峰值(图2)，但IL17的产生是暂时的，到第4天，几乎检测不到明显的IL17表达(IL17ELISA试剂盒的工作范围是15.6～1 000pg/mL)。

　　图2 MoPn呼吸道感染小鼠肺组织IL17的表达2.3 衣原体MoPn肺感染诱导前炎症细胞因子和趋化因子的表达 本实验同时测定了小鼠肺组织匀浆TNFα(图31)、IL1α(图32)、IL1β(图33)、IL6(图34)和IL8(图35)的表达情况，这些细胞因子在整个感染过程中均可检测到，TNFα、IL1α、IL1β和IL6在感染后第3天达到峰值，而IL8则在第4天出现高峰。

　　3 讨论

　　IL17在炎症病理和宿主防御多种微生物感染中具有重要的作用。然而，IL17在由严格的细胞内寄生病原体如沙眼衣原体引起的感染中的作用尚不清楚。

　　本研究用沙眼衣原体体内感染模型证实IL17在感染衣原体后在固有性免疫应答早期阶段短暂表达，从而有利于小鼠肺组织逐渐清除感染的衣原体。

　　本研究发现，鼠衣原体MoPn经呼吸道感染小鼠，IL17作为Th17细胞分泌的标志性细胞因子，在感染的早期阶段即48h就达到高峰，随后很快下降。尽管IL17并不直接影响衣原体在细胞内的生长，但其可以提高其他前炎症细胞因子和趋化因子在衣原体感染的细胞中表达，参与衣原体感染免疫防御作用。这些结果显示IL17早期表达可能作为固有免疫应答因子在起动宿主抵御细胞内病原体在早期呼吸道衣原体感染炎症应答中发挥重要的作用。

　　IL17在感染的肺组织早期出现，意味着小鼠早期固有免疫应答机制在应对急性感染中的作用。这个结论与获得性免疫反应发生在抗原暴露4d后概念相一致。事实上，早期IL17在呼吸道的产生也被诱导和作用于防御其他呼吸道病原体，包括肺炎支原体[12],肺炎克雷伯氏杆菌[13]和牛分枝杆菌[14]。这些病原体都触发了IL17的短暂产生，峰值出现与病原体复制速度呈一定的相关性。肺炎支原体感染，IL17峰值出现在第1天，肺炎克雷伯氏杆菌和牛分枝杆菌感染，峰值则分别出现在第2天和第3天，这些结果均支持本研究IL17的产生依赖于衣原体的复制和合成。事实上，除了CD4+T细胞参与获得性免疫反应，TCRγ/δT细胞、类NKT细胞、NK1.1negiNKT细胞和中性粒细胞[1518],都能参与固有性免疫反应，也能产生IL17。这些细胞可能是宿主在感染衣原体后IL17早期产生的细胞基础。

　　本实验证实IL17在感染衣原体后在固有性免疫反应应答早期短暂表达，随后很快下降，但其他细胞因子IL6,IL8,TNFα,IL1α,IL1β则分别在第3天或第8天出现高峰，基于这些资料我们认为IL17在衣原体肺炎早期出现，能提高局部IL6,IL8,TNFα,IL1α,IL1β的表达，表明IL17具有抗衣原体感染的免疫保护作用，进一步阐释了宿主感染衣原体后的免疫防御机制,对今后预防以及干预治疗衣原体感染性疾病提供了理论依据。

　　(致谢 本工作在美国得克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心微生物免疫系Dr.Zhong实验室完成)

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