缺血性脑血管病患者趋化因子受体CX3CR1基因T280M多态性的研究

　　作者：彭旭,张智博,唐璐,周颖　　作者单位：南华大学长沙市第一医院神经内科

　　【摘要】 目的 探讨缺血性脑血管病(ICVD)患者趋化因子受体CX3CR1基因T280M的多态性及其频率。方法 采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法检测165例ICVD患者(脑梗死85例，腔隙性脑梗死40例，短暂性脑缺血发作40例)与150名健康对照者(正常对照组)CX3CR1基因T280M的多态性，比较两组及ICVD亚组的基因频率。结果 正常对照组CX3CR1基因T280M只有TT和TM基因型，ICVD组有TT、TM和MM 3种基因型，两组间基因型的差异有统计学意义(P<0.05);ICVD组M等位基因频率(8.7%)明显高于正常对照组(2.3%)(P<0.01);不同ICVD亚组之间基因型及M等位基因频率的差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 ICVD患者趋化因子受体CX3CR1基因T280M有MM基因型，并且M等位基因的频率明显增高，提示CX3CR1基因T280M多态性可能与ICVD有关。

　　【关键词】 趋化因子,受体,CX3CR1;缺血性脑血管病

　　Abstract：Objective To investigate chemokine receptor CX3CR1 gene T280M polymorphism in patients with ischemic cerebrovascular disease(ICVD) and its frequency. Methods 165 patients with ICVD(cerebral infarction 85 cases, lacunar infarction 40 cases, transient ischemic attack 40 cases) and 150 age and sexmatched healthy controls(normal control group) were involved in this study.The polymorphism of T280M was analyzed by multiplex polymerase chain reactionrestriction fragment length based (PCRRFLB), the gene frequency was compared between two groups and each ICVD subgroups.Results There were TT and TM genotypes in normal control group,and TT,TM and MM genotypes in ICVD group. The genotype were significant differences between the two groups(P<0.05).The frequency of M allele was significantly higher in ICVD group(8.7%) than that in the normal control group (2.3%)(P<0.01).No significant differences were observed in ICVD subgroups in genetypes and M allele distribution(all P>0.05). Conclusions There is MM genotype in the chemokine receptor CX3CR1 gene T280M in the patients with ICVD, and their M allele frequency obviously increase.It suggests that CX3CR1 gene T280M polymorphism may be associated with ICVD.

　　Key words：chemokines;recptor;CX3CR1;ischemic cerebrovascular disease

　　缺血性脑血管病(ICVD)是一种多因素共同作用的疾病，环境与遗传因素在发病过程中均起着重要作用，传统的危险因素不能完全解释遗传在ICVD发病中的作用。动脉粥样硬化(AS)是ICVD的病理基础，单核巨噬细胞的聚集和激活贯穿AS的始终，趋化因子对单核巨噬细胞的迁移与聚集起着重要的调控作用。Fractalkine(Fkn)是人类第四家族趋化因子惟一已知的超家族成员，CX3CR1是Fkn的高亲和力受体，近年发现CX3CR1基因中存在T280M碱基突变，该基因突变与人类免疫缺陷病毒1(HIV1)、冠心病和颈动脉狭窄的发生相关[13]。为此，本研究对ICVD患者趋化因子受体CX3CR1基因T280M的多态性及其频率进行了探讨。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 (1)ICVD组：系我科2006年10月～2007年6月收治的165例ICVD患者[脑梗死85例，腔隙性脑梗死40例，短暂性脑缺血发作(TIA)40例]，均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准[4]，并经CT、MRI或者DSA检查证实。男93例，女72例;年龄41～85岁，平均(65.8±9.1)岁;病程8～28 d，平均(16.5±2.3)d。(2)正常对照组：系同期我院150名健康体检者，男86人，女64人;年龄40～84岁，平均(64.3±8.3)岁;体检正常，影像学检查排除脑血管病。两组均为湖南地区汉族人，三代无血缘关系，排除了严重的心、肝、肾功能不全、动脉炎、血液病、自身免疫性疾病、急性冠脉综合征，HIV感染者、尘肺、家族性哮喘、视网膜脉管炎、妊娠者及半年内有过降脂治疗者。两组性别、年龄差异无统计学意义(均P>0.05)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人外周血全血基因组DNA提取 受试者常规禁食12 h以上，空腹抽取肘静脉血5 ml，EDTAK2抗凝，置于-70℃低温冰箱保存。从收集的血标本中取300 μl全血，用少量外周血DNA提取试剂盒(购自北京鼎国生物有限公司)进行基因组DNA的提取，具体步骤按照试剂盒说明书操作，样本吸光度A260/280比值为1.8～1.9，样本DNA浓度为50～150 ng/μl。

　　1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 根据基因文库调取的 CX3CR1 基因序列(基因序列号：001337)，使用Prime 5软件进行引物设计，由上海Sangon公司合成。上游引物：5′TCATCCAGACGCTGTTTTCC3′，下游引物：5′AGGCATTTCCCATACAGGTG3′。T280M基因的PCR扩增在25 μl反应体系中进行，反应体系为：cDNA 1 μg，dNTPs(10 mmol/ml)1 μl，10×PCR缓冲液(不含MgCl2)2.5 μl，25 mmol/L MgCl2溶液2.5 μl，Taq DNA 聚合酶(1 U/μl，Promega公司)1 μl，加双蒸水至25 μl。PCR反应条件为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 35 s，退火60℃ 35 s，延伸72℃ 35 s，共35个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的条带长度为295 bp。

　　1.2.3 限制性片段长度多态性检测 采用限制性内切酶HpyCH4 Ⅲ(Biolabs公司)对T280M基因的目的片段酶切，在20 μl体系下进行：PCR扩增产物8 μl，10×缓冲液2 μl，限制性内切酶HpyCH4 Ⅲ(5000 U/ml)0.5 μl，加双蒸水至20 μl，酶切3 h，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶100 V电压下电泳45 min，紫外线灯下检测照相，经Eagle EyeⅡ型图像分析处理系统观察电泳图。

　　1.2.4 DNA序列分析 分别选取CX3CR1的T280M基因位点纯合子野生型、纯合子突变型、杂合子标本，经纯化后进行正反方向测序验证，测序由上海Sangon公司完成,测序结果在SNP数据库中进行分析比较。

　　1.2.5 统计学方法 采用基因计数法计算单个基因型，等位基因频率=(2×纯合子+杂合子)/(2×受检人数)，检验是否符合HardyWeinberg平衡，平衡者组间基因型及等位基因频率比较采用四格表χ2检验和R×C列联表χ2检验。所有数据处理均在SPSS 13.0软件上完成。

　　2 结 果

　　2.1 限制性片段琼脂糖凝胶电泳结果 受试者的目的产物经HpyCH4 Ⅲ酶切和琼脂糖凝胶电泳后，分别出现1条条带(295 bp，为突变型纯合子MM型)、2条条带(96 bp，199 bp;为野生型纯合子TT型)和3条条带(96 bp，199 bp，295 bp;为杂合子TM型)。

　　2.2 ICVD组与正常对照组CX3CR1基因T280M多态性分布比较 T280M基因多态性分布符合HardyWeinberg遗传平衡定律(P>0.05)，说明基因型及基因频率已经达到遗传平衡，具有群体代表性。正常对照组只有TT和TM基因型，ICVD组有TT、TM和MM 3种基因型，两组间基因型比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两组间M等位基因频率的比较：ICVD组M等位基因频率(8.7%)明显高于正常对照组(2.3%)(P<0.01)。见表1。

　　2.3 CX3CR1基因T280M多态性在ICVD不同亚型中的分布 ICVD各亚组之间基因型及M等位基因频率比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。 表1 ICVD组与正常对照组CX3CR1基因T280M基因型及等位基因频率的比较

　　3 讨 论

　　Ross[5]提出“炎症假说”是AS的主要发病机制，也有作者[6]认为AS是一种自身免疫性疾病，炎症与免疫反应是AS的内在与外在的危险因素。越来越多的临床研究[7]和动物实验[8]证明，炎症和免疫反应可引起血小板、白细胞黏附、聚集和迁移进而导致血管内皮损伤，在AS的形成中发挥重要作用，被认为是脑血管疾病的独立危险因素。趋化因子是具有趋化作用的细胞因子，有研究[9]表明趋化因子及其受体在AS中发挥重要的作用。CX3CR1属于趋化因子受体超家族成员。CX3CR1 基因位于3p21.3 [10]，由1065个核苷酸组成，编码355个氨基酸，具有7次跨膜G蛋白偶联结构域，含有趋化因子受体超家族的保守序列。Fkn/CX3CR1 系统通过提高细胞黏附，促进CX3CR1 阳性单核细胞和淋巴细胞的跨膜转移[11]，并能趋化和激活自然杀伤(NK)细胞，产生不依赖组织相容性复合体(MHC)1类分子的溶解细胞作用[12]。Nishimura等[13]发现，除了原始趋化功能外，还能提高其他趋化因子对CX3CR1+淋巴细胞的趋化功能。

　　Faure等[1]运用限制性片段长度多态性方法，发现趋化因子受体CX3CR1存在5个单核苷酸多态性位点的遗传变异。McDermott等[14]运用单链构型多态性技术明确了5个单核苷酸多态性位点，其中T280M(G→A )、T280M(C→T)、T57A(A→G)和V122I(G→A )影响蛋白的翻译，而255位单核苷酸的变异不影响翻译。T280M位点由于发生G→A的突变，可引起CX3CR1蛋白第7跨膜区中苏氨酸至甲硫氨酸的变异(Threonine 280 Methioonine)，由于结构影响功能，所以推测CX3CR1基因多态性特别是遗传突变子T280M与脑血管疾病之间存在某种联系。

　　本研究结果显示湖南汉族健康人群M等位基因频率为2.3%，与日本人群接近[15]，明显低于欧洲人群[3]，说明CX3CR1基因T280M 单核苷酸的多态性存在明显的种族差异。将ICVD组与正常对照组比较，发现ICVD组M等位基因频率明显增高，说明M等位基因可能是ICVD的遗传易感因素。进一步对ICVD亚组分析，发现M等位基因的频率在3组间差异无统计学意义，说明T280M等位基因可能与ICVD的类型无关，这与国外的研究[16]结果相吻合。

　　关于CX3CR1基因T280M突变的意义，目前仍然不明了。Gugl等[3]发现M等位基因与外周血管闭塞性疾病无关。但一项前瞻性研究[17]发现，MM基因型患者颈动脉内膜中层厚度(IMT)较TT和TM基因型患者的明显变薄，说明M等位基因能明显减少血管的IMT，对早期AS有保护作用;还有研究[2,18]表明M等位基因能显著降低冠状动脉事件的危险性。本研究结果却发现ICVD患者的M等位基因频率明显增高。有研究[19]表明，血小板活动度增加脑梗死的患病危险而与冠脉事件的发生无关，因此可以推测趋化因子在不同血管床中的表达决定了血小板的效能。Yoneda等[20]发现NK细胞的黏附功能与其介导的细胞毒作用成正相关，而可溶性的CX3CR1能抑制NK细胞的这种作用，说明CX3CR1对AS的影响除了单核细胞与血小板的因素以外，还与NK细胞介导的内皮细胞损伤有关[21]。因此，由于CX3CR1介导的细胞机制不同，而在心脑血管病中所造成的结果不同，但其具体的机制，还有待于进一步研究。

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