慢性阻塞性肺疾病TNFA和LTA基因等位基因变异分析

作者：张瑛琪 卢宝全    作者单位：唐山市工人医院呼吸内科,河北唐山063000

 【摘要】  研究中国北方汉族人群中TNF超家族基因等位基因变异是否与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关联。方法 以50例COPD患者为研究对象，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法研究TNF超家族基因（TNFA和LTA）等位基因变异分布。结果 COPD组TNFA基因多态性位点-308G/A AA基因型频率明显高于对照组（P<0.01）,OR值为10.756（95% CI为9.875～12.640）; COPD组-308G/A多态性位点A等位基因频率明显高于对照组（P<0.01）；COPD组LTA基因+252A/G多态性位点AG基因型频率明显高于对照组（P<0.01），OR值为4.373（95% CI为3.301～6.872）。COPD组TNFA基因GG正常基因型和LTA基因AG杂合基因型结合个体频率明显高于对照组（P﹤0.05）。2组间LTA基因+252 A/G多态性位点G等位基因频率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 中国北方汉族人群LTA基因等位基因变异、TNFA基因多态性变异组合与COPD相关联。

【关键词】  慢性阻塞性肺疾病 TNFA基因 LTA基因 遗传多态性

   The analysis of TNFA and LTA-gene allele variation in COPD patients

    ZHANG Yingqi， LU Baoquan

    (Department of Respiration, Worker′s Hospital of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000,China)

    Abstract: Objective  To investigate whether TNF-gene allele variation is associated with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) of Han population in northern China. Methods  50 cases of COPD were selected as subjects for TNF-superfamily-gene (TNFA and LTA) allele variation distribution by the method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Results  Compared with the control group, ①COPD group had a higher frequency of AA-genotype at TNF-gene polymorphism space point-308G/A (P<0.01), OR value was 10.756 (95% CI as 9.875-12.640); ②COPD group had a higher frequency of A allele genotype at -308G/A polymorphism space point （P<0.01）; ③COPD group had a higher frequency of AG allele genotype at LTA-gene +252A/G polymorphism space point (P<0.01), OR value was 4.737 (95% CI as 3.301-6.872); ④COPD group had higher frequency of TNFA-gene GG normal genotype and LTA-gene AG hybrid genotype (P<0.05). ⑤No significant difference in frequency of G allele genotype at LTA-gene polymorphism space point +252A/G  was found between COPD group and the control group (P＞0.05). Conclusion  The LTA-gene allele variation and the TNFA-gene polymorphism variation are associated with COPD in Han population in  northern China.

    Key words: chronic obstructive pulmonary disease; TNFA gene; LTA gene; genetic polymorphism

    慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是内科系统常见病、多发病，慢性炎症是COPD发病过程中的重要特征。参与肺部炎症调节的细胞因子在COPD发病过程中起重要作用。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是一个多功能的细胞因子，它促进气道重构，改变平滑肌细胞功能，参与肺部炎症调节，从而在COPD发病过程中起重要作用。淋巴毒素-α(lymphotoxin, LT-α)也是炎症细胞介素，主要由淋巴细胞合成。2种细胞因子都与细胞表面的相同受体有关系。编码这2种细胞因子的TNFA和LTA基因彼此连锁并位于6号染色体短臂（6p21.1-6p21.3）主要组织相容性复合体簇范围内。关于TNFA和LTA基因不同等位基因变异影响TNF-α和LT-α表达水平问题始终意见不一。已证明与G等位基因比较，A等位基因与细胞因子产物成倍的增高有关［1-2］。在亚洲某些群体发现TNFA基因的A等位基因与某些呼吸系统疾病表型关联,而在欧洲群体迄今未得到证实。LTA基因第一内含子+252A/G多态性对肺部疾病的作用研究很少。本研究的目的是探讨TNFA和LTA基因等位基因变异与COPD的相关性。

    1  资料和方法

    1.1  研究对象和分组  所有COPD患者均为中国北方汉族人，COPD组选取2004年12月—2006年2月在我院呼吸科住院的COPD患者50例，诊断符合COPD诊治指南［3］，年龄58～83岁，平均（62.41±13.38）岁。对照组选取我院同期健康体检者50例，年龄56～79岁，平均年龄（58.92±12.53）岁，X线胸片和肺功能正常。同时均排除支气管哮喘、肺癌、肺间质纤维化等呼吸系疾病及冠心病、高血压等具有遗传倾向的疾病。

    1.2  方法

    1.2.1  基因组DNA的提取  用标准苯酚-氯仿法从外周血抽提基因组DNA。

    1.2.2  PCR  TNFA基因-308G/A和LTA基因+252A/G的检测用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法。各位点引物序列、PCR片段大小及酶切反应条件见表1。PCR反应体系为25 μl，包括4 μl模板基因组DNA,10×PCR缓冲液2.5 μl，Mg2+浓度2.0 mmol/L,1 mmol/L dNTPs 2.5 μl,引物各5 pmol, Taq DNA聚合酶4 U（北京鼎国生物技术有限责任公司），不足体积用灭菌双蒸馏水补充至25 μl。TNFA基因-308G/A PCR反应循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性60 s，61℃（LTA基因+252A/G为64℃）退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环；最后72℃延伸7 min。扩增后取反应产物4 μl在2%琼脂糖凝胶上电泳15 min（电压120 V），紫外线灯下鉴定PCR产物。表1  引物序列与PCR、酶切反应条件

    1.2.3  酶切条件及体系  采用限制性片段长度多态性(RFLP)检测TNFA和LTA基因的多态性（表1）。在20 μl体系中，加入10 μl PCR产物，10×缓冲液2 μl，NcoⅠ（北京鼎国生物技术有限责任公司）4 U(0.5 μl),不足体积用灭菌双蒸馏水补充，37℃孵育5～6  h。

    1.2.4  TNFA和LTA基因多态性的分析  对于TNFA和LTA基因，分别取酶切产物5 μl在含0.5 μg溴化乙啶（EB）（1 g/L）的3%琼脂糖凝胶上电泳15～20 min，根据紫外灯下观察到的酶切产物片段长度鉴定等位基因并照相。

    1.3  统计学处理  采用SPSS 11.5进行统计学分析。各组间各基因型和等位基因频率的比较以及Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验采用χ2检验；相对危险度采用比值比（odd ratio, OR）和95%可信区间（confidence  interval, CI）。统计学显著性检验均为双侧，以P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  TNFA和LTA基因的突变位点及突变规律  TNFA基因-308G/A多态性位点PCR产物经NcoⅠ酶切后电泳结果见图1。TNFA基因PCR产物长度为107 bp,G等位基因特点是存在NcoⅠ酶切点，可被切成87 bp和20 bp 2个片段。A等位基因无NcoⅠ酶切点，为107 bp 1个片段。所以，在电泳后GG基因型为87 bp和20 bp 2个片段;AA基因型为107 bp 1个片段；AG基因型为107 bp、87 bp和20 bp 3个片段。LTA基因+252A/G多态性位点PCR产物经NcoⅠ酶切后电泳结果见图2。LTA基因PCR产物长度为368 bp，其中A等位基因特点是缺少NcoⅠ酶切点为368 bp 1个片段，G等位基因存在NcoⅠ酶切点被切成235 bp和133 bp 2个片段。所以，在电泳后AA基因型为368 bp 1个片段;GG基因型为235 bp和133 bp 2个片段;AG基因型为368 bp、235 bp和133 bp 3个片段。

    2.2  Hardy-Weinberg平衡检验结果  在TNFA和LTA基因中，COPD组、对照组各种基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡规律（表2）。

    2.3  2组TNFA基因-308G/A多态性位点基因型和等位基因频率分布的比较  见表2。与对照组比较，COPD组TNFA基因-308G/A多态性位点AA基因型频率明显高于对照组（P=0.008），COPD组-308G/A多态性位点A等位基因频率也明显高于对照组(P=0.004)。表2  TNFA基因-308G/A多态性位点基因型和等位基因频率分布

    2.4  2组LTA基因+252A/G多态性位点基因型和等位基因频率分布的比较  见表3。与对照组比较，COPD组LTA基因+252A/G多态性位点AG基因型频率明显高于对照组（P=0.001），2组间LTA基因+252A/G多态性位点G等位基因频率差异无统计学意义（P＞0.05）。表3  LTA基因+252A/G多态性位点基因型和等位基因频率分布

    2.5  TNFA和LTA基因多态性位点基因型组合（TNFA-LTA）关联分析  因为TNFA和LTA基因产物功能上同属于一个炎症介质系统，所以分析其基因型的组合与COPD发生风险关联是合理的。根据Warzocha等［4］提出的高风险和低风险基因型,将所有可能的基因型组合分为2组，仅存在1个与细胞介素高产物关联的等位基因（TNFA基因A等位基因或LTA基因G等位基因）的基因型组合属于低风险组：即GG-AA、GG-AG、GA-AA组合。与TNF-α或LT-α增高分泌作用有关的2个以上等位基因的基因型组合列入高风险组：即GG-GG、GA-AG、GA-GG、AA-AA、AA-AG、AA-GG结合。基因型组合频率分布见表4。COPD组和对照组之间高风险和低风险基因型组合频率差异无统计学意义（P=0.73）。表4  TNFA和LTA基因多态性位点基因型组合（TNFA-LTA）关联分析

    3  讨  论

    本研究结果提示，TNFA基因AA基因型与我国COPD患者的易感性明显相关。与相关资料比较，本研究COPD患者TNFA基因A等位基因频率与日本和韩国COPD患者TNFA基因A等位基因频率相似［5］。但欧洲COPD患者中TNFA基因A等位基因与发病无关联。意大利COPD患者TNFA-308A等位基因频率为11%，欧洲出生健康个体组和非阻塞性支气管炎患者组该等位基因频率为10%，这与相应对照组A等位基因频率高有关系（8%～27%）。

    本研究结果还显示COPD组LTA基因+252A/G多态性位点AG基因型频率比对照组显著增高，但G等位基因频率与A等位基因频率与对照组差别不大。COPD组和对照组的LTA基因G突变等位基因频率为30%，这可能与研究的病例例数较少有关。 Patuzzo等［6］研究了意大利COPD(n=66)患者LTA基因+252A/G多态性，未发现TNFA和LTA基因多态性变异与发病之间的关系。Yamaguchi等［7］研究日本的结节病患者的遗传多态性时发现，G等位基因是慢性病程标记基因。

    一些研究表明，LTA基因突变可以影响LT-α表达水平，可能对COPD发病机制具有意义。但是这个细胞介素生物学功能目前很少研究。已知LTA基因突变等位基因G与人类外周血单核细胞介素更多产物关联。此外，发现G等位基因处于与LTA基因编码区域的突变连锁，它引起蛋白质产物26位天门冬酰胺替代苏氨酸（Thr26Asn）,可以影响LT-α的生物活性水平。但是为了证实这个假说尚需要进一步的研究。

    Barnes等［8］研究人外周血淋巴细胞时发现NF-κB因子诱导和LT-α诱导之间相关，而NF-κB转录因子是炎症应答的许多基因表达调控的主要因子之一,在氧化剂、细菌、病毒和不同抗原等作用下活化合成炎症细胞介素TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、巨噬细胞和粒细胞-克隆刺激因子，以及参加COPD病理过程的IL-8。分析TNFA和LTA基因多态性位点基因型组合，在COPD患者中常出现TNFA基因的GG基因型和LTA基因AG杂合基因型组合的个体，这个基因型组合的个体COPD发生风险明显增高。

    意大利研究者进行了健康对照组和COPD患者组之间基因型组合类似分析［6］。COPD患者最常出现的GG-AA组合频率为45%，对照组为45.9%；COPD患者组GG-AG组合频率（29.2%）没有超过健康对照组（31.5%），但在COPD组观察到GG-GG和GA-AA组合频率增高倾向。

    我们的研究描述了TNFA、LTA基因的基因型，以及TNFA和LTA基因的基因型组合，它们与COPD的易感性相关。在临床上可作为遗传性标记进行检测，用于早期发现COPD的易感人群，对于预防COPD的发生发展具有一定的实际意义。但几种基因型的多态性显然不能解释COPD发病中全部的基因调控机制及其遗传易感性［8］。今后的工作将集中在多基因的多态性与COPD易感性的关系，以寻找出预防COPD发生发展的多种基因标志。

【参考文献】  ［1］ Wilson AG， Symons JA， McDowell TL， et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(7):3195-3199.

［2］ Palmer SM, Klimecki W, Yu L, et al. Genetic regulation of rejection and survival following human lung transplantation by the innate immune receptor CD14［J］. Am J Transplant,2007,7(3):693-699.

［3］ 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性肺疾病诊治指南［J］.中华结核和呼吸杂志,2002,25(8):453-460.

［4］ Warzocha K, Ribeiro P, Bienyenu J, et al. Genetic polymorphisms in the tumor necrosis factor locus influence non-Hodgkin′s lymphoma outcome ［J］. Blood,1998,91(10):3574-3581.

［5］ Huang SL, Su CH, Chang SC. Tumor necrosis factor-α gene polymorphism in chronic bronchitis ［J］. Am J Respir Crit Care Med,1997,156(5):1436-1439.

［6］ Patuzzo C, Gilè LS, Zorzetto M, et al. Tumor necrosis factor gene complex in COPD and disseminated bronchiectasis ［J］. Chest,2000,117(5):1353-1358.

［7］ Yamaguchi E, Itoh A, Hizawa N, et al. The gene polymorphism of tumor necrosis factor-β, but not that of tumor necrosis factor-α, is associated with the prognosis of sarcoidosis ［J］. Chest,2001,119(3):753-761.

［8］ Barnes PJ. Nuclear factor-kappa B ［J］. Int J Biochem Cell Biol,1997,29(6):867-870.