肝内胆管结石易感基因的研究进展

　　作者：蒋禹综述,雷正明审校　　作者单位：四川 泸州，泸州医学院附属医院肝胆外科

　　【摘要】 肝内胆管结石是东亚地区的常见病、多发病。其成石机制尚未完全阐明，致石胆汁的形成是肝内胆管结石形成的先决条件之一。本文就影响胆汁酸、磷脂以及胆红素代谢的相关基因的研究进展以及与肝胆管结石的关系作一综述。

　　【关键词】 肝内胆管结石; 易感基因

　　肝内胆管结石即原发性肝胆管结石，流行于中国内地、香港、韩国和日本等东亚地区。西方少见，但随着亚裔移民的增多，这种病在西方也时有发现[1]。该病的临床病程特点为反复发作的胆管炎、肝脓肿、急性梗阻性化脓性胆管炎、肝功能异常、胆汁性肝硬化，且与胆管细胞癌密切相关。有报道肝内胆管结石合并肝内胆管癌发病率约为73%，且难以在早期诊断[2]。虽然随着肝胆疾病诊疗技术的发展，部分患者获得了较长的无石期，但治疗效果仍不理想，残石率、复发率仍很高。

　　我国肝胆管结石以胆色素结石为主，但肝内原发性胆固醇结石的发病率呈上升趋势，其确切的成石机制仍未阐明。20世纪60年代以来国内外学者先后提出了β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)学说、“胆红素钙”沉淀-溶解平衡学说。但进一步的研究却出现了很多不支持的证据，比如很多肝内胆管结石患者胆汁中并未发生细菌感染，而且肝内胆红素钙结石的化学组成与肝外胆管的棕色胆色素结石并不相同，前者含有更多的胆固醇、较少的胆红素和胆汁酸[1]。目前国内外研究普遍认为肝内胆管结石形成与多种因素有关：如细菌和寄生虫感染、胆管狭窄梗阻与胆汁淤积、胆管炎、肝脏生化/代谢缺陷与胆汁成分改变、遗传与环境因素等[3]。当前的病因学研究热点集中在肝脏生化/代谢缺陷与胆汁成分改变形成致石胆汁以及基因研究方面。

　　致石胆汁(Lithogenic bile)的形成是肝内胆管结石形成的先决条件之一，其机制复杂，目前认为胆汁中胆固醇含量增加，胆汁酸，磷脂含量减少，游离胆红素和单结合胆红素含量增加是影响致石胆汁形成的重要因素之一[4]。受基因调控的肝脏生化/代谢出现缺陷就可能导致致石胆汁形成。目前关于胆囊胆固醇结石易感基因的研究较多而基于肝内胆管结石的研究较少，本文将就可影响胆固醇代谢、胆汁酸代谢、磷脂代谢以及胆红素代谢进而形成致石胆汁的肝内胆管结石易感基因的研究进展作一综述。

　　1影响胆固醇及胆汁酸代谢的基因

　　正常人每日约合成1~15g胆固醇，其中约2/5(05~06g)在肝内转化为胆汁酸。排入肠道的胆汁约95%以上被肠道重吸收。重吸收的胆汁酸经门静脉入肝，被肝细胞摄取。在肝细胞内，游离胆汁酸被重新合成结合胆汁酸，与新合成的胆汁酸随胆汁排入小肠，即肠肝循环(enterohepatic cycle)。人体每天约进行6~12次肠肝循环，重吸收的的胆汁酸总量可达12~32g。这一过程和肝脏以及肠道上分布的一系列转运体密切相关。

　　11人类载脂蛋白A1基因(Apo-A1)位于人类第11号常染色体(11q23-q24)，编码载脂蛋白A1，其转录产物是高密度脂蛋白(HDL)中载脂蛋白的主要成分，也是与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)颗粒相关的重要蛋白。其主要功能是激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)，识别HDL受体。载脂蛋白A1是卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCTA)的一种激活剂。LCAT可催化卵磷脂2位脂肪酶转移到游离胆固醇使之成为胆固醇酯，即胆固醇酯化。酯化的胆固醇在胆固醇转运蛋白(CETP)作用下转移至VLDL使之转变成LDL或转移至HDL内核。最后大部份胆固醇酯经间接途径、非选择摄取和选择性摄取三种途径回流入肝。肝脏摄取的胆固醇酯则进一步合成胆汁酸排出体外或转运至肾上腺、卵巢、睾丸合成相应激素[5]。总之，载脂蛋白A1(Apo-A1)是胆固醇逆转运过程的关键因素，它使胆固醇从肝外细胞中流出，经过一系列的代谢转化之后进入肝脏被降解清除或者合成激素。若ApoA1基因发生改变致其转录的Apo-A1结构或氨基酸组成发生变化，则可导致激活LCTA能力下降，减缓酯化反应，使胆固醇清除能力降低，已知其与冠心病呈负相关。进一步的研究发现Apo-A1是胆汁中胆固醇成核抑制因素之一，Ohta T等的研究发现肝胆管胆固醇结石病人的病变肝组织和胆管中其含量减少，同时胆汁中胆固醇浓度升高，胆汁酸浓度下降[6]。而胆汁中胆固醇浓度增加，胆汁酸浓度降低正是致石胆汁形成的要素之一。以上实验提示提示Apo-A1与致石胆汁形成有密切关系，Apo-A1基因是肝胆管结石病重要候选易感基因。在体外孵育的肝细胞中发现Apo-A基因启动子序列-826 至-814可与胆汁酸受体(FXR)结合而被抑制，也可与肝细胞核因子4α(HNF4α)竞争性结合而激活[7]。目前已知Apo-a1基因有超过五十种变型，其中13种与淀粉样病变有关[8]，但影响胆固醇代谢的变型仍有待深入研究。

　　12胆汁酸受体(FarnnesoidX receptor，FXR)基因位于人类第12号常染色体(12q121)，为配体激活的转录因子。因FXR能被法尼醇(Farnes01)激活，所以称之为FXR。其在肝脏中的靶基因是胆固醇α羟化酶(CYP7A1)。FXR与胆酸结合后被激活，激活后的FXR通过对两个核受体：小分子异源二聚体伴侣 (Short heterodimer partner，SHP)和肝脏受体类似物 1 (Liver receptgr homolog-1，LRH-1)的调节来实现对CYP7A1的调控。研究证明CYP7A1上的反应元件必须与LRH-1结合才能被激活转录活性。FXR通过诱导SHP的表达，使SHP与LRH-1结合形成杂二聚体而失活，间接抑制CYP7A1的转录活性，导致胆汁酸合成、分泌减少[9]。FXR在肝脏中的另一个靶基因是胆汁酸输出泵(bile salt export pump，BSEP)。BSEP是ABC转运蛋白超家族中的一员，主要分布肝胆管侧膜上，促进胆汁酸排出到胆汁中[10]。同时，FXR还可以与小肠中的回肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile—acid binding protein，I-BABP)基因启动子近端上的反应元件IRl(inverted repeats1)结合发挥其对I-BABP基因的调节作用。I-BABP是一种溶解蛋白，能与胆汁酸结合，促进胆汁酸的重吸收[11]。FRX通过调节胆汁酸的合成、分泌、以及再回收来维持内环境胆汁酸的稳态，FXR基因敲除小鼠表现为肝脏和血浆中胆固醇和甘油三酯升高，当这些转运蛋白功能异常时，会导致胆固醇浓度上升的致石胆汁形成[12]。

　　13顶膜钠依赖性胆盐转运体(apical sodium-dependent bile salt transporter，ASBT)肝肠循环中胆汁酸的重吸收以回肠部对结合型胆汁酸的自动重吸收为主，这一过程和肠道上分布的一系列转运体密切相关,其中最主要的是表达在回肠壁腔细胞侧膜上的顶膜钠依赖性胆盐转运体。ASBT基因位于染色体13q33(人类)，16q12(大鼠)，8A1(小鼠)[13]。其分子调控机制尚未阐明，已知胆汁酸、细胞因子、激素和甾醇类等对ASBT基因的转录具有调控作用。在人类和小鼠中胆汁酸可以通过作用于FXR诱导SHP的表达，通过与LRH-1形成杂二聚体失活来间接抑制ASBT基因的表达[14]。在人类和大鼠中ASBT基因可被vitamin D3上调，其机制尚不清楚。炎性因子可通过活化蛋白(AP1)位点降低ASBT基因表达，但最新的研究显示胆汁酸可通过EGF-receptor 和 ERK1/2在活性蛋白(AP-1)位点激活ASBT基因[15]。如果ASBT基因发生缺陷可以造成转运蛋白功能改变,进而影响胆汁的肝肠循环.当肝脏合成胆汁酸能力不足以代偿肠道丢失的胆汁酸时，就会导致排入胆汁中的胆固醇增多，而胆汁酸减少，进而形成致石胆汁。另外，ASBT还被认为是囊性纤维化跨膜转运调节物(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR/ABCC7)激活的先决条件。CFTR存在于胆管细胞膜上，作为氯离子通道蛋白它使氯离子易于进入胆汁，当基因突变致CFTR蛋白缺陷时将使胆管上皮对氯离子通透性下降，HCO3-的分泌发生障碍，胆汁pH值随之下降，使胆汁中非结合胆红素和胆红素钙的溶解度下降，更易形成结石[16]。随着对ASBT基因研究的深入，其基因结构特性，功能及调控方式逐渐被我们所了解，其在致石胆汁形成过程中得作用也越来越受到研究者的重视。

　　2影响磷脂代谢的基因

　　胆汁中的脂质主要由磷脂和胆固醇组成，其主要来源是血浆中的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以及肝细胞的重新合成。磷脂的分泌机制仍有很大一部分是未知的，但却是至关重要的，它不仅为胆汁中的胆固醇排泄提供了通路，还与胆盐形成混合微粒，保护胆管上皮不受胆盐的毒性作用。

　　21ABCB4基因(ATP binding cassette transporter b4) 位于人类第7条常染色体(7q21.1)上。主要在肝脏毛细胆管膜上高度表达，在人类编码多重药耐性蛋白3(multidrug resistance protein 3，MDR3)，而在啮齿类动物则编码多药耐药蛋白2(MDR2)。目前，对ABCB4基因及其编码的MDR3的生物学作用的研究主要来源于与小鼠同源的MDR2的研究。Smit等的研究显示，mdr2基因失活(敲除)小鼠的胆汁中既没有磷脂也没有胆固醇。而mdr2基因破坏的杂合体小鼠的胆汁中减少了40%的磷脂，而胆固醇及胆盐分泌正常[17]。这个结果表明mdr2主要是一个磷脂转运体。因此推测MDR3基因编码卵磷脂的跨膜转运子。其作用是依赖 ATP的磷脂翻转酶，把磷脂的位置从胆小管膜内侧改变到外侧。它能促进胆固醇的分泌，另外磷脂与胆汁酸形成微胶粒，能保护胆管不受胆汁酸介导所引起的损害。当ABCB4基因表达异常时，可导致胆汁中磷脂的缺乏，胆盐与磷脂构建的混合微胶粒不能形成，胆盐游离，将引起胆管细胞损伤以及胆汁淤积，最终形成致石胆汁。而mdr3的完全缺失，临床上表现为进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)[18]。

　　22磷脂酰胆碱转运蛋白(phosphatidylcholine transport protein，PCTP)基因位于人类第11条常染色体上(Location :11 C; 11 520 cM )，是类固醇激素合成急性调节转运蛋白超家族(START)的一员，其编码产物属于胞内转运蛋白。PCTP参与肝细胞中卵磷脂的结合与运输。目前关于PCTP的研究结果主要来自牛和小鼠肝脏，虽然其生化性质及结构已经清楚，但其在人类活体的作用机制仍不清楚。人们一直猜测PCTP与肝脏中卵磷脂代谢和胆固醇代谢的调控有关，但Michele K. Wu等使用PCTP基因敲除小鼠和野生型C57BL/6J(高表达PCTP) 和FVB/NJ(低表达PCTP)小鼠为模型，分别饲以普食和致石饮食(lithogenic diet)。结果发现普食组PCTP基因敲除组小鼠其胆汁中脂质及其它组分无改变，而在致石饮食组，其胆汁酸、磷脂分泌均较野生型小鼠出现明显损害。由此得出PCTP在致石饮食诱导的脂质、胆汁酸分泌中扮演重要角色[19]。进一步的研究发现，肝胆管结石病人肝组织中PCTP mRNA表达明显降低，而胆汁中磷脂含量减少。可能是pctp基因表达障碍使磷脂排入毛细胆管减少，导致致石胆汁形成而易于结晶成石[20]。由以上实验可知，若PTCP基因表达缺陷，以及长期致石饮食的影响，就可能出现低胆汁酸、低磷脂的胆汁出现。其更深入的分子机制仍需要进一步研究。

　　3影响胆红素代谢的基因

　　胆红素是血红蛋白的氧化降解产物，首先在体循环中与白蛋白结合，随后肝细胞从血液摄取胆红素，在滑面内质网UDP-葡萄糖醛酸转移酶的作用下，将葡萄糖醛酸结合到胆红素的丙酸基上，形成胆红素葡萄糖醛酸酯(即结合胆红素)，其水溶性增加，毒性降低，有助于从胆汁、尿、粪便中排出。

　　胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(bilirubin UDP-glucuronosytransferase，B-UGT)UGT是一个酶超家族，参与体内一系列内源性化合物(如胆红素、甾类激素、胆汁酸、短链脂肪酸和脂溶性维生素等)和外源性化合物(如药物、化学致癌药、外界污染物等)的生物转化。UGT超基因家族分为两个大家族，即：参与酚和胆红素代谢的UGT1家族和参与类固醇代谢的 UGT2家族.。B-UGT属于UGT1家族，其编码基因是是UGTlAl，位于人类第二号常染色体(2q37)，在肝脏中该酶参与胆红素代谢且活性最高[21]。UGTlAI基因的缺陷表现为Gilbert综合征和Crigler-Najjar综合征(CN综合征)。Gilbert综合征UGTlAl基因的突变位点位于启动子区的侧翼，即在TATAA盒插入了额外的TA盒又名UGTlAl*28基因。CN综合征突变位点位于UGTlAl基因的编码区[22]。Foulk等在20世纪60年代报道在Gilbert综合征患者中胆石症发病率较高，提示胆石形成可能与肝脏胆红素葡糖糖醛酸酯化障碍有关。在动物实验中：叙利亚金黄地鼠胆固醇结石及胆色素结石模型肝组织中，其成石组肝组织中B-UGT活性显著低于对照组(P<0 05);在两成石组胆囊胆汁中单结合胆红素(MCB)所占比例均明显高于其相应对照组(P<0.05)，而双结合胆红素(DCB)所占比例相应下降，非结合胆红素(UCB)所占比例无明显变化(P>0.05)。由于MCB水溶性很差，易沉淀，而且MCB是单离子，更易与胆汁中钙离子结合形成钙盐沉淀[23]。在中国台北的一项实验中发现：UGT1A1与台湾地区病人的胆管结石病有关，可能是由该基因启动子区域的TA盒多态性所致[24]。由于B-UGT基因缺陷使B-UGT活性降低，直接影响胆红素酯化过程，使胆汁中不稳定、易沉淀的中间代谢产物单结合型胆红素(MCB)异常升高，可能参与结石形成。

　　4结语与展望

　　自1995年Paigen和Cnrey利用近交系小鼠发现首个小鼠致石基因-Lith1基因起，迄今已经有23种Lith基因被确认，其中Lith1和Lith2的重要性已经得到肯定[25]。但以上实验结果均是胆囊胆固醇结石病候选基因，且大多来自动物实验。而关于肝内胆管结石易感基因的研究还鲜有报道。从启动肝脏生化代谢缺陷的始动因子和遗传因素角度探讨肝内胆管结石病成因，对了解肝内胆管结石的发病机制可能具有重要价值。

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