RNA干扰Bcl2基因表达对人胆囊癌细胞株GBCSD裸

　　作者：王林,潘晓涛,耿智敏　　作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 探讨RNA干扰Bcl2基因表达对人胆囊癌细胞GBCSD裸鼠体内成瘤能力和移植瘤生长的影响。方法 本课题分为成瘤能力和治疗两个方面。成瘤能力：用针对Bcl2基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体稳定转染的人胆囊癌细胞GBCSD和人胆囊癌细胞GBCSD分别制作裸鼠模型，观察移植瘤的生长情况，计算肿瘤成瘤率、生长体积、生长率。治疗实验：制作人胆囊癌细胞GBCSD移植瘤模型，随机分为pSilencerTMEGFP sh515组(实验组)、pSilencerTMEGFP shCon组(空载体阴性对照组)和正常对照组。实验组用Bcl2基因的siRNA真核表达载体多点注射于移植瘤周围，空载体阴性对照组用空载体多点注射于移植瘤周围，正常对照组不作处理，观察移植瘤的生长情况，计算肿瘤生长体积、生长率。6周后处死裸鼠，剥离瘤体组织进行称重，并采用免疫组化检测Bcl2蛋白的表达。结果 ①成功地建立裸鼠人胆囊癌GBCSD细胞的动物模型;②成瘤能力：人胆囊癌细胞GBCSD组和Bcl2 siRNA稳定转染细胞组成瘤率分别为100%、60%，瘤体平均体积分别为(1914.6±125.0)mm3、(629.7±78.9)mm3，平均生长率分别为45.58%、14.99%，瘤体重量分别为(2.24±0.33)g、(0.77±0.12)g，两组比较差异均有统计学意义(P<0.05);③治疗实验：实验组、空载体阴性对照组及正常对照组瘤体平均体积分别为(729.7±66.6)mm3、(1493.2±98.9)mm3、(1548.67±101.0)mm3，瘤体平均重量分别为(0.82±0.10)g、(1.68±0.21)g、(1.90±0.25)g，平均生长率分别为18.711%、38.286%、39.709%。实验组与空载体阴性对照组及正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而空载体阴性对照组与正常对照组比较无明显差异。结论 针对Bcl2基因siRNA真核表达载体转染人胆囊癌GBCSD细胞可以有效降低Bcl2基因的表达，该基因沉默后肿瘤细胞增殖受到抑制，体内成瘤能力下降，瘤体生长减慢。

　　【关键词】 胆囊癌;Bcl2基因;RNA干扰;移植瘤;基因治疗;裸鼠

　　growth of human gallbladder carcinoma xenograft in nude miceWANG Lin, PAN Xiaotao, GEN Zhimin

　　(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate whether RNA interference in mediated Bcl2 gene silence can decrease the gallbladder carcinoma xenograft formation rate and inhibit growth of xenograft in nude mice. Methods In the xenograft formation ability group, the Bcl2siRNAs were transfected into the gallbladder carcinoma cell. Transfected gallbladder carcinoma and gallbladder carcinoma were injected into nude mice hypodermically to form a gallbladder carcinoma tumor. The formation rate and volume of the tumors were measured and the tumor growth rates were calculated. In the therapy group, the animal models of human gallbladder carcinoma in nude mouse body were constructed. The nude mice were randomly divided into pSilencerTMEGFP sh515 group, pSilencerTMEGFP shCon group, and normal control group. After the formation of tumor knot, siRNA expressing plasmids pSilencerTMEGFP sh515 and pSilencerTMEGFP shCon were injected into the knots of pSilencerTMEGFP sh515 group and pSilencerTMEGFP shCon group. The tumor volume was measured and tumor growth rate was calculated. All mice were sacrificed after 6 weeks. The distribution of Bcl2 in the tumors was detected by immunohistochemistry. Results The nude mouse model of human gallbladder cancer xenograft tumor was constructed successfully. Xenograft formation ability: The xenograft formation rate of gallbladder carcinoma and Bcl2 siRNA transfected gallbladder carcinoma was 100% and 60%, respectively; the average tumor volume in gallbladder carcinoma group and transfected gallbladder carcinoma group was (1914.6±125.0)mm3 and (629.7±78.9)mm3; the growth rate was 45.58% and 14.99%, and the average tumor weight was (2.24±0.33)g and (0.77±0.12)g, respectively. The tumor volume, weight and growth rate in the transfected gallbladder carcinoma group decreased significantly when compared with those in control group(P<0.05). Therapy group: The average tumor volume in pSilencerTMEGFP sh515 group, pSilencerTMEGFP shCon group and control group was (729.7±66.6), (1493.2±98.9) and (1548.67±101.0)mm3; the average tumor weight was (0.82±0.10)g, (1.68±0.21)g and (1.90±0.25)g; the average growth rates was 18.711%, 38.286% and 39.709%, respectively. The average tumor volume, weight and growth rate of pSilencerTMEGFP sh515 group were significantly smaller than those in pSilencerTMEGFP shCon group and normal control group (P<0.05), and there was no significant difference between pSilencerTMEGFP shCon group and normal control group. Conclusion Gallbladder carcinoma GBCSD cells infected with siRNA vector can effectively lower the level of Bcl2 gene expression. After silence of Bcl2 gene, the proliferation of GBCSD cells is markedly inhibited, and the xenograft formation rate and growth rate are decreased significantly.

　　KEY WORDS: gallbladder garcinoma; Bcl2 gene; RNA interference; xenograft; gene therapy; nude mice

　　细胞凋亡是机体重要的生理过程，凋亡调节紊乱有助于细胞的恶性转化和肿瘤的进展，因此研究凋亡的调节机制对于弄清肿瘤的发病机制及提供新的防治措施具有重要意义。Bcl2基因是一种抑制细胞凋亡的基因。相关研究发现，在多种恶性肿瘤组织中Bcl2基因均有高表达，胆囊癌亦不例外，提示Bcl2基因在胆囊癌的发生和发展过程中起着重要作用[1]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发展起来的一种基因沉寂技术，具有很强的转录后基因沉默作用，已广泛用于抗肿瘤的研究中[2]。本课题以人胆囊癌GBCSD细胞系作为研究对象，以Bcl2基因作为靶基因，将针对Bcl2基因siRNA真核表达载体稳定转染到人胆囊癌GBCSD细胞中后制作转移瘤动物模型系统，观察其成瘤能力及肿瘤的生长情况;同时观察针对Bcl2基因siRNA真核表达载体体内局部注射抑制人胆囊癌GBCSD细胞裸鼠移植瘤的作用，从而为针对Bcl2基因的RNA干扰技术治疗胆囊癌提供客观的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 质粒、细胞及试剂 Bcl2 特异性siRNA表达载体pSilencerTMEGFP sh515(重组质粒)和pSilencerTMEGFP shCon(空载体)由张勇、张岷博士惠赠，第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室第四实验室保存;人胆囊癌细胞GBCSD细胞株由西安交通大学医学院中心实验室购买;脂质体2000购于Sigma公司;兔抗人Bcl2多克隆抗体(AB1720)购自Chemicon公司。

　　1.2 实验动物 4～6周龄的BALB/c裸鼠(18～22g)，实验动物质量合格证号：SCXK(沪)20030003，由第四军医大学实验动物中心提供，西安交通大学动物实验中心SPF级饲养。

　　1.3 方法

　　1.3.1 人胆囊癌细胞GBCSD的培养 人胆囊癌细胞贴壁生长于含10%(体积分数)新生小牛血清RPMI1640的培养液中，置37℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度培养箱内培养，待贴壁细胞密度生长至80%～90%后，按照1∶2比例传代。

　　1.3.2 细胞转染 人胆囊癌细胞转染前24h，将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后按照每孔1×105细胞的密度重新接种6孔板，继续培养24～48h，待贴壁细胞密度长至约90%时，进行脂质体2000介导的DNA转染。每孔细胞，用250μL无血清培养液(RPMI 1640培养液)稀释4.0μg DNA，轻轻震摇，使之充分混匀;用250μL RPMI 1640培养液稀释8μL lipofectamine 2000转染试剂，轻轻摇匀，5min内与质粒混合，摇匀，室温放置20min。将6空板中的旧营养液吸出，用RPMI 1640培养液清洗两遍，再加入2mL无血清培养基;将脂质体DNA混合物加入6孔培养板中，轻轻混匀，置于孵箱37℃、5%(体积分数)CO2培养4～5h后，吸去培养液，加入含有10%(体积分数)新生牛血清的RPMI1640培养液，置于孵箱培养;48h后，加入160mL/L 潮霉素b及含10%(体积分数)新生牛血清的RPMI1640培养液培养4～6周，收集单细胞集落，扩大培养，获得抗性克隆细胞。

　　1.3.3 裸鼠成瘤实验 ①成瘤能力实验。取10只4～6周的BALB/c裸鼠，按随机数字表法分为Bcl2 siRNA实验组和对照组。实验组：将siRNA稳定转染细胞瘤的细胞悬液0.2mL，约6×106细胞/只，注入小鼠左后腋下皮下;对照组：在左后肢腋下种植人胆囊癌细胞GBCSD。②治疗实验。取15只4～6周的BALB/c裸鼠，于右后肢腋下皮下分别接种6×106人胆囊癌细胞GBCSD/只，建立人胆囊癌GBCSD细胞裸鼠肿瘤模型。5～7d成瘤后按随机数字表法将裸小鼠分为3组(n=5)：pSilencerTMEGFP sh515组(实验组)、pSilencerTMEGFP shCon组(空载体阴性对照组)及正常对照组。每隔2d，将10μg DNA重组质粒pSilencerTMEGFP sh515和pSilencerTMEGFP shCon(阴性对照)分别与30μL Lipofectamine 2000脂质体(Invitrogen)混匀，多点注射于实验组及空载体阴性对照组裸鼠瘤体周围组织中，共注射5次。

　　1.3.4 移植瘤生长情况的观察 每日观察裸鼠的一般情况，每隔3d测量肿瘤大小，按公式：V= πa2b/6计算肿瘤体积(a：肿瘤短径，b：肿瘤长径)，测量计算生长率：平均生长率=平均肿瘤体积(mm)3/宿主带瘤时间(d)，绘制注射细胞后肿瘤生长的曲线图。6周后处死裸鼠，取出肿瘤，称重，并切取肝、肺、脾、肾等组织，以10%(体积分数)甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成4～5μm厚的切片。瘤体切片用于Bcl2基因表达的免疫组织化学染色以判断其表达情况;其余组织切片均行HE染色，以判断有无转移及毒副作用。

　　1.3.5 统计学分析 实验计量数据以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS 10.0统计学软件处理。组间比较采用t检验或方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 成瘤能力实验

　　2.1.1 移植瘤的生长情况 对照组和Bcl2 siRNA实验组成瘤率分别为100%和60%，瘤体平均体积分别为(1914.6±125.0)mm3和(629.7±78.9)mm3，平均生长率分别为45.586%和14.99%，瘤体平均重量分别为(2.24±0.33)g和(0.77±0.12)g。对照组瘤体的平均体积、平均生长率、平均重量明显大于Bcl2 siRNA细胞组(P<0.05，图1)。

　　2.1.2 组织病理学变化 裸鼠不同组织的HE染色结果表明，除裸鼠瘤体组织有坏死外，其余各部分组织形态正常。免疫组化染色显示，对照组染色信号较强，阳性表达率为(50.4±1.3)%;Bcl2 siRNA实验组染色信号较对照组信号为弱，阳性表达率为(28.2±2.1)%，两组比较后者显著降低(P<0.05，图2)。

　　2.2 治疗实验

　　2.2.1 移植瘤的生长情况 实验组瘤体平均体积、平均生长率、平均瘤体重量明显小于空载体阴性对照组和正常对照组(P<0.05)，空载体阴性对照组和正常对照组比较差异无统计学意义(表1、图3)。 表1 各组瘤体的平均体积、平均生长率和平均瘤体重量的比较

　　2.2.2 组织病理学变化 裸鼠各组织的HE染色表明，除裸鼠瘤体组织有坏死外，其余各部分组织形态正常。免疫组化染色显示，空载体阴性对照组和对照组瘤体Bcl2阳性表达率分别为(51.2±2.3)%，(53.0±1.7)%，两者比较无显著性差异(P>0.05)。实验组染色信号最弱，Bcl2阳性表达率为(34.5±2.8)%，显著低于其他两组 (P<0.05)。

　　3 讨 论

　　近年来分子生物学研究表明，原发性胆囊癌为多基因、遗传、环境致癌因素等诱导下综合作用的结果，细胞凋亡在胆囊肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。Bcl2基因是细胞凋亡中最重要的调节因子之一。研究发现在胆囊癌中Bcl2基因有高表达。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来产生的新兴生物技术，能够作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。RNAi技术已开始应用于多种恶性肿瘤的基因治疗中，如在慢性淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤中取得了较好的效果，但在胆囊癌的治疗中尚处于实验阶段。因此，研究RNAi技术在胆囊癌中的作用将有助于为胆囊癌的基因治疗提供理论依据。

　　本研究的成瘤能力实验结果表明，在体外进行以Bcl2为靶点的干扰可以显著降低人胆囊癌GBCSD细胞的增殖能力，导致细胞的成瘤能力显著下降，已成瘤的生长能力下降。基因治疗实验结果表明，针对Bcl2基因siRNA真核表达载体的重组质粒组体内局部注射可以一定程度地抑制人胆囊癌GBCSD细胞裸鼠移植瘤的生长。

　　本研究采用裸鼠皮下构建胆囊癌模型。我们之所以采用6～8周龄的BALB/c健康裸鼠，是为了避免随着裸鼠年龄增长或有关因素的影响，裸鼠体内正常免疫系统会增强而影响接种成功率。另外，裸鼠虽无T淋巴细胞，但仍有免疫球蛋白、自然杀伤细胞、吞噬细胞等，随着裸鼠成熟或在感染情况下，这类免疫功能将成熟或被激活，使接种成功率降低。本实验利用人胆囊癌GBCSD细胞系接种裸鼠皮下，移植瘤成功率达到100%，也提示了胆囊癌的高度恶性和有较强的成瘤能力。

　　许多研究表明，以腺相关病毒、逆转录病毒及慢病毒为载体的体内治疗可以获得满意的效果[3]。这种表达的载体能够注射到局部，并高效地转染细胞，但病毒载体能引起有害的免疫反应，比直接注射具有更大的风险。质粒是最早被用来向细胞内引入siRNA表达框的载体，由于其构建相对简单，在研究中被广泛采用。然而由于其对部分类型细胞的转染效率较低，限制了其在体内实验中的应用。在本实验中，我们用脂质体介导的裸鼠移植瘤重组质粒的多点注射也可以达到一定程度的基因沉默效果。由此可见，体外实验中有效的脂质体介导的转染同样在一定程度上可以应用于体内实验。SORENSEN等[4]向腹腔内注射脂质体包裹的siRNA可以有效地预防细菌产生的脂多糖类物质所引起的败血症。ZHANG等[5]通过静脉内注射免疫脂质体来传送siRNA可以起到对特定类型细胞的转染。

　　另外，在裸鼠体内形成人胆囊癌GBCSD细胞瘤模型后，自瘤内及瘤周注射siRNA脂质体复合物时，为试图克服siRNA体内易降解的缺点，我们采用了多次注射的方法。但实验同时发现，与转染空质粒组相比，质粒载体表达的siRNA虽能使人胆囊癌GBCSD细胞裸鼠移植瘤生长速度减慢，但肿瘤生长率仍很高;虽能使Bcl2的表达减少，但减少的程度非常有限，肿瘤细胞仍有较高水平Bcl2表达，并且其表达水平是否会因传染后时间的长短而有所改变以及如何改变，在本实验中并未涉及。因此，如何使siRNA的转染更加高效，探索更加适宜的转染载体、转染途径、转染时机是需要我们进一步研究的内容。

　　总之，本研究首次应用RNAi技术，干扰Bcl2基因对人胆囊癌GBCSD细胞在裸鼠体内影响，在国内尚未见报道。实验证实，以Bcl2基因为靶基因，通过RNAi技术沉默此基因，可以使人胆囊癌GBCSD细胞在裸鼠体内成瘤能力下降，生长减慢。这一结论为胆囊癌的基因治疗提供一个新的研究方向。

　　【参考文献】

　　[1]LI SM, YAO SK, YAMAMURA N, et al. Expression of Bcl2 and Bax in extrahepatic biliary tract carcinoma and dysplasia [J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(11):25792582.

　　[2]MEISTER G, TUSCHL T. Mechanisms of gene silencing by doublestranded RNA [J]. Nature, 2004, 431(7006):343349.

　　[3]HOMMEL JD, SEARS RM, GEORGESCU D, et al. Local gene knockdown in the brain using viralmediated RNA interference [J]. Nat Med, 2003, 9(12):15391544.

　　[4]SORENSEN DR, LEIRDAL M, SIOUD M. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice [J]. J Mol Biol, 2003, 327(4):761766.

　　[5]ZHANG Y, ZHANG YF, Bryant J, et al. Intravenous RNA interference gene therapy targeting the human epidermal growth factor receptor prolongs survival in intracranial brain cancer [J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(11):36673677.