姑息性肝切除促进肝细胞癌侵袭潜能的实验研究

　　作者：黄修燕　黄自丽　许永华　郑起　汤钊猷　黄新余 作者单位：200233　上海，上海交通大学附属第六人民医院普外科(黄修燕、郑起、黄新余);上海市徐汇区中心医院影像科(黄自丽、许永华);复旦大学肝癌研究所(汤钊猷)

　　【摘要】 目的　研究姑息性肝切除对肝脏残余癌(简称残癌)侵袭潜能的影响。方法　以高转移人肝癌细胞系MHCC97H建立裸鼠原位移植瘤模型，12只成模裸鼠于接种肿瘤后14 d随机分成两组，包括姑息性肝切除组(保留2 mm大小残癌)和假手术组。姑息术后14 d 处死裸鼠，采用侵袭实验检测残癌原代培养细胞穿膜能力变化，免疫酶联吸附实验(ELISA)、明胶酶谱实验和原位肿瘤组织MMP2活性实验分别用于检测MMP2分泌水平及其活性。SAS 8.2软件用于统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。结果　所有裸鼠模型均成功构建。原代培养细胞用于侵袭实验的结果显示姑息性肝切除术后，残癌侵袭潜能增强。姑息组穿膜细胞数[(38.9±3.9)个]多于对照组[(34.6±2.8)个](P=0.015)。术后14 d，ELISA实验检测到姑息组原代培养上清液MMP2分泌水平[(59.7±8.0) ng/ml]较对照组[(39.4±6.1) ng/ml]升高(P=0.025);原代培养上清液明胶酶谱实验和原位肿瘤组织MMP2活性实验[姑息组OD450(3.3±0.3)高于对照组(2.1±0.3)(P=0.005)]显示残癌MMP2活性增强。结论　姑息性肝切除促进肝癌细胞侵袭能力增强可能与上调MMP2分泌并激活MMP2相关。

　　【关键词】 癌，肝细胞;　肝切除术;　姑息疗法;　肿瘤浸润;　动物，实验

　　原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是病死率很高的恶性肿瘤，为世界第三位、中国第二位的肿瘤死亡原因[1]，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在我国占PLC的90%[2]。临床上已有多种方法治疗HCC，手术切除仍是目前治疗HCC公认的最有效的方法之一[3]，但即使根治性手术切除后，5年内仍有60%～70%的患者出现转移复发，其高转移、复发率是制约预后改善的瓶颈。上海交通大学附属第六人民医院和复旦大学肝癌研究所1958～2008年8107例HCC手术患者中，姑息性肝切除患者5年生存率为30%，明显低于根治性肝切除患者，临床观察发现姑息性肝切除患者很快出现复发、转移，暗示了姑息性肝切除可能改变了肝脏残余癌(简称残癌)生物学特性[4]，为此需要研究干预的靶点和有效的干预途径。目前，国内、外在肝切除影响原位移植瘤转移潜能的分子机制探讨及干预策略方面尚缺乏系统性研究。笔者前期研究发现，姑息性肝切除促进残癌肺脏转移[5]，本文重点研究姑息性肝切除术后，残癌侵袭潜能的改变及其可能的机制，为最终提高姑息性肝切除疗效提供实验依据。

　　一、资料与方法

　　1. 细胞株：高转移人HCC细胞株MHCC97H由复旦大学肝癌研究所建立，液氮保存，裸鼠原位移植后可出现100%肺转移。

　　2. 实验动物来源和饲养条件：BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠，鼠龄4～6周，体重17～20 g，购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分公司，动物健康合格证号SCXK(沪)2003-0003。在恒温(24～27 ℃)、恒湿(45%～50%)、新鲜空气高度除尘除菌、无特殊病原菌(SPF)环境下分笼饲养，水和饲料经灭菌处理供裸鼠自由摄入。

　　3. 主要仪器与试剂：胎牛血清(美国Hyclone公司);DMEM培养基(美国Gibco/BRL公司);胰蛋白酶(美国Difco公司);人工重组基底膜胶(美国BD公司);Transwell小室 (8-μm pore size，美国Corning Costar公司);MMP2试剂盒(美国R&D公司分装ELISA试剂盒);MMP2活性检测试剂盒(美国R&D公司);倒置相差显微镜(德国Laika公司);紫外分光光度计(3550-UV型，美国Bio-Rad公司)。

　　4. 建立高转移人肝癌裸鼠原位移植瘤模型：MHCC97H细胞株复苏后，培养于含有10%胎牛血清的DMEM中，处于对数生长期的细胞经0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度至2.5×107/ml，取0.2 ml接种于裸小鼠右前肢腋部皮下。接种3周后皮下肿瘤约1.0 cm×1.2 cm×1.2 cm，脱颈处死裸鼠，消毒、铺巾，完整剥离瘤体，生理盐水清洗瘤体2次后剪成大小为2 mm×2 mm×2 mm瘤块浸于生理盐水中。受体鼠经2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射，麻醉满意后腹部消毒、铺巾，行左上腹肋缘下斜切口进腹，切口长8 mm，暴露肝左叶，眼科显微镊斜行刺破肝包膜，切开肝脏，植入1个瘤块，6-0医用无损伤缝合线“8”字缝合、止血完善后将肝脏轻轻送回腹腔，5-0医用无损伤缝合线全层关腹，术后送返无菌动物房，裸鼠自然苏醒，自由进食。整个手术操作在无菌超净台内进行，术后不用抗生素。

　　5.动物分组及处理：术后14 d将12只成模裸鼠随机分成2组，姑息组：切除大部分肿瘤和部分肝脏，在瘤体深部保留直径2 mm的肝癌组织，6-0医用无损伤缝合线“8”字缝合、止血，5-0医用无损伤缝合线全层关腹[6];假手术组：仅麻醉、开腹。姑息术后14 d 两组处死裸鼠，部分肿瘤冻存备用，部分肿瘤组织行原代细胞培养：无菌获取残癌组织(尽量剔除肝组织)置于含血清DMEM液(10～20 ml，视情况而定)中，机械法剪碎肿瘤组织，适当用力吹打细胞，使成纤维细胞沉降到底部，吸取稍混浊上清至25 cm培养瓶中，24 h换液，第1代稳定培养并传代。第2代部分冻存备用，部分继续培养至80%细胞密度，并计数。第3 代用于侵袭实验;收集24 h无血清上清及细胞。

　　6. 侵袭实验、免疫酶联吸附(ELISA)实验、明胶酶谱实验及原位肿瘤组织MMP2活性实验：具体实验步骤详见笔者前期报道[7]。

　　7. 统计学分析：运用SAS 8.2统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差(x-±s)表示，采用单因素方差分析法(One way ANOVA);计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　二、结果

　　1. 模型观察和病理结果：所有模型均成功构建，对照组原位移植瘤呈椭圆形或圆形，包膜完整、较薄，呈灰白色，粗颗粒状，质地偏硬。镜下观察：对照组癌与肝组织分界较清楚，癌细胞大小不一，核大浓染，胞质较少。姑息组癌与肝组织分界欠清楚。

　　2. 姑息性肝切除促进残癌侵袭潜能：原代培养细胞用于侵袭实验的结果显示姑息性肝切除术后，残癌侵袭潜能增强。姑息组穿膜细胞数[(38.9±3.9)个]多于对照组[(34.6±2.8)个](P=0.015，图1)。

　　3. 姑息性肝切除增强残癌MMP2表达和活性：术后14 d， ELISA实验检测到姑息组原代培养上清液MMP2分泌水平[(59.7±8.0) ng/ml]较对照组[(39.4±6.1) ng/ml]升高(P=0.025，图2A);原代培养上清液明胶酶谱实验(图2B)和原位肿瘤组织MMP2活性实验[姑息组OD450(3.3±0.3)高于对照组(2.1±0.3)(P=0.005，图2C)]显示残癌MMP2活性增强。

　　三、讨论

　　肝切除影响肿瘤生物学特性(如生长、转移潜能)的研究结果有过不同报道。有学者研究认为部分肝切除延长患者生存期，但因肿瘤侵袭、肝内播散和肝外转移的特点使术后患者总体预后不良[8]。更多的学者报道部分肝切除加速肿瘤生长、促进肿瘤转移[5,9-13]。其发生的机制可能是手术去除残癌生长生成抑制因子、增加残癌血管生成、促进远处转移[4]，但具体机制不明，肝切除对肿瘤生长和转移的影响目前仍存争议。

　　基质金属蛋白酶(MMPs)是一类Zn2+依赖性的蛋白分解酶，能降解细胞外基质和基底膜，肿瘤浸润转移过程中在肿瘤细胞穿越细胞外基质和基底膜时起重要作用。MMP2是MMPs家族中主要成员之一，通过降解细胞外基质、调节细胞黏附促进肿瘤的浸润、转移，其过表达与肿瘤的浸润、转移有关[14]。研究表明[15]，MMP2激活后的过量表达造成细胞外基质和基底膜的降解，同时，MMP2促进肿瘤血管形成和使细胞间的黏附能力降低，使肿瘤细胞容易向周围浸润转移。

　　文献报道肝切除促进肝癌MMP2 表达，裸鼠部分肝切除组与非切除组相比，肝癌组织MMP2表达由(8.22±3.02) pu上调为(14.25±4.24) pu[16]。笔者前期研究发现姑息性肝切除促进残癌转移潜能，残癌转移相关基因功能网络发生显著变化，转移抑制基因1(MTSS1)成为基因功能网络的枢纽基因[5]。我们另外一部分研究结果显示MTSS1促进snail转录，进而促进MMP2分泌和活性，MTSS1基因表达抑制后HCC细胞侵袭、转移潜能明显下降(数据即将发表)。Boyden小室体外侵袭实验常用于评估HCC细胞侵袭能力[17]，本研究发现姑息性肝切除促进残癌侵袭潜能，残癌组织中MMP2活性增强可能是 HCC侵袭能力增加的最终主要原因之一，但具体机制有待进一步阐明。

　　总之，基于文献报道和我们前期的研究结果，有必要进一步探索HCC术后残癌转移潜能改变的分子调控机制，这必将为HCC治疗和预后判断的改善提供新的途径。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

　　[1]　Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics,2008.CA Cancer J Clin,2008,58(2)：71-96.

　　[2]　Tang ZY，Ye SL，Liu YK，et al.A decade′s studies on metastasis of hepatocellular carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol,2004,130(4)：187-196.

　　[3]　Zhou XD，Tang ZY，Ma ZC，et al.Twenty-year survivors after resection for hepatocellular carcinoma-analysis of 53 cases.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(8)：1067-1072.

　　[4]　黄修燕，王鲁，汤钊猷.肝癌切除术对残癌及机体免疫状态的影响.肝胆胰外科杂志，2007,19(5)：336-339.

　　[5]　黄修燕，黄自丽，汤钊猷，等.姑息性肝切除术后残癌转移潜能及其基因功能网络变化的实验观察.中华医学杂志，2010,90(18)：1278-1282.

　　[6]　Broomfield S， Currie A， van der Most RG，et al.Partial，but not complete，tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy.Cancer Res,2005,65(17)：7580-7584.

　　[7]　Huang XY，Wang L，Huang ZL，et al.Herbal compound extract “Songyou Yin” inhibits tumor growth and prolongs survival in nude mice bearing human hepatocellular carcinoma xenograft with high metastatic potential.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(9)：1245-1255.

　　[8]　Huo TI，Lin HC，Huang YH，et al.The model for end-stage liver disease-based Japan Integrated Scoring system may have a better predictive ability for patients with hepatocellular carcinoma undergoing locoregional therapy.Cancer,2006,107(1)：141-148.

　　[9]　García-Alonso I，Palomares T，Alonso A，et al.Effect of liver resection on the progression and growth of rhabdomyosarcoma metastases in a rat model.J Surg Res,2008,148(2)：185-190.

　　[10]　de Jong KP， Lont HE， Bijma AM，et al.The effect of partial hepatectomy on tumor growth in rats：In vivo and in vitro studies.Hepatology,1995,22(4 Pt 1)：1263-1272.

　　[11]　Harun N，Nikfarjam M，Muralidharan V，et al.Liver regeneration stimulates tumor metastases.J Surg Res,2007,138(2)：284-290.

　　[12]　Picardo A，Karpoff HM，Ng B，et al.Partial hepatectomy accelerates local tumor growth：Potential roles of local cytokine activation.Surgery,1998,124(1)：57-64.

　　[13]　García-Alonso I，Palomares T，Alonso A，et al.Effect of hepatic resection on development of liver metastasis.Rev Esp Enferm Dig,2003,95(11)：771-776,765-770.

　　[14]　Pizybylo JA， Radisky DC. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition：tumor progression at Snail′s pace.Int J Biochem Cell Biol,2007,39(6)：1082-1088.

　　[15]　陈连周，夏金堂，李雯，等.PTEN和MMP-2表达与肝细胞肝癌生长、侵袭及转移[J/CD].中华临床医师杂志：电子版，2008,2(11)：24-27.

　　[16]　龚时文，区庆嘉，闵军，等.裸鼠肝部分切除后肝癌组织基质金属蛋白酶-2及其抑制剂表达.肿瘤学杂志，2003,9(3)：183-184.

　　[17]　王德盛，李郁，杨薛康，等.RhoA基因转染对QZG肝细胞生物学行为的影响及其机制的研究[J/CD].中华临床医师杂志：电子版，2009,3(10)：26-29.