谷氨酸和基质金属蛋白酶-9与脑梗死相关性研究

　　作者：吴跃华,张茂林,周立社,杨巧莲,刘丹　　作者单位：1.包头市第四医院神经内科，内蒙古包头 ;2.包头医学院第一附属医院;3.包头医学院生物化学与分子生物学教研室

　　【摘要】目的：通过观察脑梗死患者血清谷氨酸(Glu)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平的动态变化与梗死面积、神经损害的关系，从临床方面探讨二者在脑梗死发展过程中的作用。方法：对70例脑梗死患者发病第3天和第14天的血采用高效液相色谱法测定Glu，采用酶联免疫法测定MMP-9，进行不同时程和同期神经功能缺损程度、脑梗死体积进行相关分析，并与30例正常人做对照分析。结果：70例脑梗死患者发病第3天时血浆Glu、MMP-9浓度均显著高于对照组(P<0.05)，CTV≥10cm3与CTV<10cm3比较差异有统计学意义(P<0.05)，CSS>30与CSS≤30之间比较差异有统计学意义(P<0.05)，第3天Glu、MMP-9水平呈正相关，r=0.499,P<0.001。结论：Glu和MMP-9参与脑梗死的病理过程，脑梗死急性期血浆Glu、MMP-9水平可作为判断梗死面积大小、病情轻重及预后的客观指标。

　　【关键词】 脑梗死,基质金属蛋白酶-9,谷氨酸

　　Abstract Objective: To observe the dynamic changes of glutamate(GLU) and metalloproteinase-9(MMP-9) in patients with cerebral infarction and the relation of Glu、MMP-9 levels to infarction size and intensity of neurological deficit and to investigate clinically the effect of Glu and MMP-9 on the time course in ischemic stroke by detecting Glu and MMP-9 in plasma. Methods: By high -performance liquid chromatography (HLPC),Glu concentration in plasma was determined and by ELISA MMP-9 concentration in plasma was measured in 70 patients with acute cerebral infarction(ACI) and 20 controls on the third day and 14th day after onset. At the same time, Canadian Stroke Scale (CSS) score and cerebral infarction volume (CTV) were also obtained and analyzed. Results: Mean plasma Glu、MMP-9 concentrations in 70 patients significantly elevated compared with controls on the third day, (P<0.05).Moreover, Mean plasma Glu、MMP-9 concentrations in patients with CTV≥10 cm3 and CSS >30 were significantly higher than those in the patients with CTV<10 cm3 and CSS≤30 , (P<0.05).On the third day Glu concentrations was significantly positively correlated with MMP-9 in plasma (r=0.499,P<0.001).Conclusion: Glu、MMP-9 are involved in the pathologic process of cerebral infarction. The concentrations of Glu and MMP-9 may be taken as an objective guide to judge the degree, size of infarction area and the recent prognosis in acute cerebral infarction .

　　Key words Cerebral infarction;Metalloproteinase-9;Glutamate

　　脑组织缺血损伤是一个非常复杂的病理生理过程。目前认为急性缺血后神经元的损伤呈进行性瀑布式连锁反应，主要包括兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎性细胞浸润和程序性死亡4种机制。谷氨酸(Glu)可导致兴奋性毒性、梗死周围去极化，基质金属蛋白-9(MMP-9)可导致炎症反应，虽然它们所产生的时程和作用并不相同，但均为急性缺血性脑损害的重要环节。本课题采用病例对照研究方式，对急性脑梗死患者血清Glu、MMP-9进行对照研究，并观察其在不同时间、不同病损范围及不同神经功能缺损程度的含量变化特点，寻找二者可能作用神经元缺血性损伤的多个病理环节和途径，以待从分子生物学水平寻求急性脑梗死治疗的科学理论依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 病例组 选择在本院住院并且发病在3天之内的脑梗死患者70例为脑梗死组，男46例，女24例，年龄45～75岁，平均年龄65.4岁，均经头颅CT或MRI证实，并均符合第四届全国脑血管病会议通过的诊断标准，且除外以下情况：(1)发病前两周有感染;(2)伴发心血管、肝、肾疾病及癌性疾病;(3)短暂脑缺血发作;(4)头颅CT或者MRI未发现病灶;(5)住院后有明显的感染;(6)治疗时使用含氨基酸的药物。

　　根据1995年第四届全国脑血管疾病学术会议通过的脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(CSS)，将脑梗死组分为：重型(31～45分)19例，中型(16～30分)26例,轻型(0～15分)25例。根据头部CT或MRI图象测算，梗死灶体积按Pullicino公式(长×宽×层数÷2)计算，将70例脑梗死组分为:大梗死灶组(LI)18例，病灶体积>10cm3;中梗死灶组(MI)24例，病灶体积4～10cm3;小梗死灶组(SI)28例，病灶体积<4 cm3。

　　1.1.2 对照组 选择未入院做健康体检者30例为对照组，男19例，女11例，年龄45～75岁，平均年龄60.6岁。脑梗死组年龄、性别与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

　　1.2 方法 受检者均分别在病程第3天、第14天清晨6时空腹时采集静脉血4mL入抗凝管，室温下静置2小时后，2 000转/分离心10分钟，取上清液装于干燥试管内，封口放于-30℃低温冰箱中保存待测。Glu测定采用高效液相色谱法，MMP-9测定采用酶联免疫吸附法。Glu试剂盒由天津永大化学试剂公司提供，MMP-9试剂由美国Amersham Biosciences提供，操作严格按说明书进行。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件包进行区组设计方差分析、单因素方差分析、两样本比较t检验、线性相关分析等。

　　2 结果

　　2.1 脑梗死组与对照组血清Glu、MMP-9水平比较 与对照组相比，脑梗死组在病程第3天血清Glu、MMP-9水平明显升高(P<0.05);第14天时，二者水平仍高于正常水平(P<0.05)，见表1。表1 脑梗死与对照组患者血清Glu、MMP-9水平比较*与对照组比较P<0.05;﹟与14天比较P<0.05

　　2.2 脑梗死患者血清Glu水平、MMP-9水平与梗死面积大小动态比较 脑梗死患者血浆Glu水平及MMP-9水平与脑梗死面积大小呈正相关(r=0.426,P<0.001)，即脑梗死面积越大，血清Glu水平及MMP-9水平越高。血清Glu水平及MMP-9水平随梗死面积的变化以病程第3天最明显(P<0.05)，见表2。 表2 脑梗死患者血清Glu、MMP-9水平 与梗死面积大小动态比较 *与MI、SI比较P<0.05;﹟与SI比较P<0.05

　　2.3 不同程度神经功能受损患者血清Glu水平、MMP-9水平动态比较 脑梗死组血清Glu水平、MMP-9水平均与神经功能受损程度(轻型、中型、重型)呈正相关(r=0.526, P<0.001)，即脑卒中患者，临床神经功能受损程度越重血清Glu水平、MMP-9水平越高。血清Glu、MMP-9水平随神经功能受损程度变化以病程第3天最明显(P<0.05)，见表3。表3 不同程度神经功能受损患者血清Glu、MMP-9水平动态比较*与轻、中度脑梗比较P<0.05;﹟与轻度脑梗比较P<0.05

　　脑梗塞组患者第3天血浆Glu水平与MMP-9水平呈正相关(r=0.499,P<0.001)。

　　3 讨论

　　Glu是脑组织中含量最高的一种氨基酸[1]，是重要的兴奋性氨基酸(EAA)递质。生理情况下，Glu主要存在于神经末梢的Glu囊泡中，神经末梢去极化时，释放到突触间隙，作用于突触后膜的Glu受体，完成兴奋性突触传递及其它生理作用。但脑缺血可引起病变区神经元持续去极化，导致神经元大量释放Glu，而Glu重摄取受到抑制，故Glu在突触间隙内大量滞留引起Ca2+大量内流，反过来又加重Glu释放由此形成恶性循环。Glu显著升高，持续作用于其受体，引起对受体的过度刺激，最终导致神经损伤，此过程称作Glu的神经兴奋性毒性。

　　MMP-9是人体内最重要的蛋白酶之一。属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，又称明胶酶B，是一种依赖金属锌离子的金属酶。MMP-9主要来源于单核细胞、巨噬细胞、角化细胞、中性粒细胞、内皮细胞等。在人体内是以前体或酶原的形式分泌，通过自身催化或某些酶(如纤溶酶)的作用被激活。在生理情况下，能够切断任何细胞外基质成分、调节细胞粘着、作用于细胞外成分或其他蛋白成分而启动潜在生物学功能[2-4]。在病理情况下，如脑卒中时，MMP-9是引起微循环损伤的主要成分，其通过降解脑血管周围基底膜主要成分Ⅳ型明胶原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白致脑血管基底膜破坏，使其通透性增高、渗出增加，从而破坏血脑屏障，形成脑水肿以及继发性脑出血，在脑损伤过程中发挥着重要的病理生理学效应[5]。

　　本研究结果显示，Glu、MMP-9与缺血性脑损伤过程存在着一定联系，具有一定叠加作用。Glu的兴奋性毒性与MMP-9表达所引起的一系列病理损害进程的研究，将为脑梗死治疗提供一种分子生物学基础。应用Glu、MMP-9拮抗剂将可能改善神经元的功能，是我们以后进一步研究的重要思路之一。

　　【参考文献】

　　[1] Konomidou C,Bosch F,Miksa M,et al.Blockade of NMDA receptor and apoptotic neurodegeneation in the developing brain[J].Science,1999,283(5398):70.

　　[2] Takahara M,Naruse T,Takagi M,et al.Matrix metalloproteinase-9 expression,tartrate resistant acid PH ospHatase activity,and DNA fragmention in vascular and cellular invision into cartilage preceding primary endochondral ossification in long bones[J].J Orthop Res,2004,22 (5):1050-1057.

　　[3] Fubayana H,Ishikawa SE,Kubo N,et al.Increase in interleukin-6 and matrix metalloproteinase-9 in the infarct-related coronary artery of acute myocardial infarction[J].Circ J,2004,68(5):451-454.

　　[4] Hulkkonen J,Pertovaara M,Antonen J,et al.Matrix metalloproteinase 9(MMP-9)gene polymorphism and MMP-9 plasma levels in primary sjogren's syndrome[J].Rheumatology(Oxford),2004,43(12)：1476-1479.

　　[5] Gusche Y,Fujimura M,Morita Fujimura Y,et al.Early appearance of matrix metalloproteinase-9 after focal cerebral ischemia in mice:a possible role in blood brain barrier dysfunction[J].J Cereb Blood Flow Metab,1999,19:1020-1028.