原发性肝癌中肝细胞生长因子mRNA的定量表达及其临床意义

　　作者：浦涧，汪建初，韦忠恒，李良波，韦建宝，严浩然，覃志坚 作者单位：右江民族医学院附属医院，广西百色533000

　　【摘要】目的 对原发性肝癌组织、癌旁组织以及正常肝脏组织肝细胞生长因子(HGF) mRNA进行定量测定，分析其表达与临床特征的关系，探讨其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR检测59例原发性肝癌组织、相对应癌旁组织以及17例正常肝脏组织HGF mRNA 的表达量，分析其表达量与性别、年龄、血清HBsAg、AFP、分化程度、肿瘤大小、临床分期、转移状态以及是否合并肝硬化等临床特征的关系。结果 HGF mRNA在原发性肝癌组织、癌旁组织中的表达与正常肝脏组织差异无显著性(P>0.05)。HGF mRNA在肝癌合并肝硬化组中的表达明显高于未合并肝硬化组(P<0.05)，但与其它临床特征无关。结论 HGF mRNA在肝癌合并肝硬化组织中呈高表达，提示可能与肝癌发生发展有关。

　　【关键词】 肝肿瘤 聚合酶链反应 肝细胞生长因子 原癌基因蛋白质c-met

　　A clinical study on human HGF messenger RNA expression and its clinical implications in primary hepatocellular carcinoma

　　PU Jian, WANG Jian-chu, WEI Zhong-heng, LI Liang-bo,

　　WEI Jian-bao, YAN hao-ran, QIN Zhi-jian

　　Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China

　　Abstract: Objective To investigate the expression of hepatocyte growth factor (HGF) mRNA and analyze whether HGF mRNA expression levels correlate with clinicopathologic variables in patients with primary hepatocellular carcinoma(HCC). Methods Tissue samples, including 59 cancerous, adjacent non-cancerous tissues and 17 normal liver tissues were obtained from patients who underwent surgical resection. The expression of HGF mRNA was quantitatively analyzed by real-time PCR. Moreover, the relationship between HGF mRNA expression and clinicopathologic characters (such as sex, age, serum, HBsAg, AFP, differentiation degree, tumor size, clinical staging, metastasis, complicated with liver cirrhosis or not) were examined by statistical analysis. Results The expression of HGF mRNA in HCC patients complicated with liver cirrhosis was significantly higher than those without liver cirrhosis (P<0.05). However, no significant difference was observed among HCC tissues, adjacent non-cancerous and normal liver tissues (P>0.05). There were no significant correlations between HGF mRNA and other clinicopathologic characters as well. Conclusions The HGF mRNA expression increased significantly in HCC patients complicated with liver cirrhosis, suggesting that it may be correlated with the development of HCC.

　　Key words: liver neoplasms; polymerase chain reaction; hepatocyte growth factors; proto-oncogene protein c-met

　　肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)又称肝细胞扩散因子( hepatocyte scatter factor, HSF)，是目前研究促进肝细胞增殖最强的细胞因子，其受体c-Met (原癌基因的表达产物)过表达于多种肿瘤细胞，HGF作用于受体c-Met，形成了HGF/c-Met信号转导系统，体外实验表明HGF能刺激多种肿瘤细胞的分裂、增殖、运动、离散，与肿瘤的发生、发展关系密切[1,2]。有研究显示血清HGF水平在多种肿瘤包括肝癌中显著增高[3～5]，且HGF mRNA在肝癌诱变不同时期表达存在差异[6]。然而，HGF mRNA在原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达以及与其临床特征的关系未见文献报道，本研究采用实时荧光定量PCR检测HGF mRNA在原发性肝癌中的表达，初步探讨其与原发性肝癌的发生、发展、浸润转移的关系以及临床应用的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　所有59例标本均来自2002～2006年右江民族医学院附属医院手术切除标本，手术切除组织立即液氮冻存，肿瘤组织均经病理检查证实，为原发性肝细胞癌。其中男43例，女16例，年龄(48.6±12.4)岁。癌旁组织取自距上述肝癌病变边缘2.0cm的肝组织共59份。另取肝外伤病人的正常肝脏17份作为正常对照，其中男10例，女7例，年龄(46.9±11.2)岁。

　　1.2 仪器与试剂

　　Trizol Reagent、SuperScript Ⅱ逆转录试剂盒、DNaseⅠ购自美国Invitrogen 公司，PCR试剂购自上海申能博彩生物公司。SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增采用TaKaRa(宝生物工程大连有限公司)试剂盒。HGF引物：上游：5’-TGCTCCCCATCGCCATCCCCTATG-3’;下游：5’-TATAGCACCATGGCCTCGGCTGG-3’，产物长度为：756bp。GAPDH：上游引物：5’-CCAATATGATTCCACCCATG-3’;下游引物：5’-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，产物长度为:195 bp，引物由上海英俊生物有限公司合成。ABI7500 荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

　　1.3 总RNA抽提及反转录

　　取冻存组织100mg，加入Trizol Reagent 1ml，匀浆后加入0.2ml氯仿，离心后吸取上清，加入0.5 ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，70%乙醇洗沉淀，DNase I酶解可能残余的基因组DNA，RNA溶于DEPC水，甲醛变性凝胶电泳和以260nm及280nm吸光度值计算所获RNA含量及纯度，分装后-80℃保存待用。反转录操作按Superscript Ⅱ(Invitrogen 公司)提供操作说明书进行，所得cDNA -20℃保存。

　　1.4 实时荧光定量RT-PCR扩增效率检测

　　用EASY Dilution 将cDNA 液按100、101、102、103和104梯度稀释后，各取2μl进行荧光定量PCR反应，检测目的基因的扩增效率和GAPDH(管家基因) 的扩增效率的一致性，Ct值为荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。ΔCt=Ct(HGF)-Ct(GAPDH)。

　　1.5 实时荧光定量PCR

　　25μl反应体系中含cDNA样品2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5μl，上、下游引物(20pmol/μl)各0.5μl，Rox Reference Dye 0.5μl，去离子水补足25μl。设置95℃预变性10s，95℃变性5s，61℃延伸31s，共40个循环。以GAPDH为内对照。采用比较循环阈值法(2-ΔΔCt)分析样本中HGF的相对含量[7]。具体计算方法如下：以正常肝组织作为对照因子，设为1，分别将肝癌组织、癌旁组织与正常肝组织做比较，得倍数为N(N=2-ΔΔCt)，其中ΔΔCt=ΔCt(癌或癌旁组织)-ΔCt (正常肝组织)。

　　1.6 统计学分析

　　采用SPSS 11.5 统计软件包进行统计学处理，各组之间的差异采用完全随机设计资料方差分析，数据之间的两两比较采用SNK法，肿瘤的临床资料参数间的比较采用两组独立样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 总RNA完整性检测

　　琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA的完整性，紫外下观察电泳结果，可见28S、18S、5S三条清晰的条带，其中28S和18S条带明亮，表明提取的RNA完整(见图1)。且熔解曲线显示特异性较好(见图2)，可用于实时荧光定量PCR。

　　2.2 实时荧光定量RT-PCR扩增效率检测结果

　　原发性肝癌组织中HGF和GAPDH 的cDNA经梯度稀释后，其相对关系数分别为0.9995和0.9994，斜率分别为-3.444和-3.487，扩增效率分别为1.94和1.95。可以认为目的基因的扩增效率与管家基因的扩增效率相同，浓度改变时样本的扩增效率可保持稳定，误差在可容许的范围内，故可用ΔΔCt 方法进行相对定量。

　　2.3 实时荧光定量PCR对HGF mRNA表达的检测

　　HGF mRNA在原发性肝癌组织和癌旁组织中的表达稍高于正常肝脏组织，但差异无显著性(P>0.05)，见表1。原发性肝癌组织HGF mRNA的表达与临床特征的关系，见表2。HGF mRNA在肝癌合并肝硬化组中的表达明显高于未合并肝硬化组(P<0.05)，但其表达与患者性别、年龄、血清HBsAg、AFP水平、肿瘤大小、分化程度、临床分期以及淋巴结转移等临床特征无关(P>0.05)。表1 正常肝组织、肝癌组织及癌旁组织HGF mRNA的表达情况(略)表2 原发性肝癌组织HGF mRNA的表达与临床特征的关系(略)

　　3 讨论

　　肝细胞生长因子(HGF)最初是从大鼠血浆和血小板中分离得到的一种分泌型肝素亲和糖蛋白，是目前研究的生物学活性最广泛的生长因子。现已知，由间质细胞产生，通过旁分泌方式作用于邻近细胞，与细胞表面的受体c-Met结合并激活该受体的酪氨酸激酶活性从而促进包括肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、黑色素细胞、造血细胞等多种类型细胞的生长、迁移和形态发生。在胚肝和胎盘的发育中有重要作用，参与维持和更新肝、肺、肾等器官的细胞，并促进这些器官的再生和损伤后修复。此外，对不同来源的肿瘤细胞有促侵袭作用或者生长抑制作用。因此，被认为是一种多功能的细胞因子。研究表明，肝癌患者血清HGF水平明显升高，且可作为预后指标[4，5]，此外，HGF mRNA在大鼠肝癌诱变过程中不同时期表达存在明显差异[6]。

　　本研究采用实时荧光定量PCR定量检测HGF mRNA在原发性肝癌中的表达，结果显示HGF mRNA在原发性肝癌中的表达与其在正常肝脏中的表达无明显差异，且与性别、年龄、血清HbsAg、血清AFP水平、肿瘤大小、肿瘤分化程度、临床分期以及转移状态等临床特征无关，但合并肝硬化的肝癌HGF mRNA 的表达明显高于未合并肝硬化组，提示肝癌组织中HGF mRNA升高可能是由于肝硬化引起的。肝硬变早期肝细胞变性、坏死，肝细胞损伤严重，产生大量HGF，促进了肝脏再生与修复，肝硬变期肝细胞损伤趋于稳定，肝组织大量纤维化，HGH mRNA 表达下降，说明HGF 产生也将减少;在肝细胞癌变后，HGF mRNA 表达下降至正常。大量HGF 对肝细胞分化增殖产生过度刺激的作用，有利于肝细胞的恶性转化及肝癌发生。由此推测，HGF mRNA可能与肝癌的发生发展有关。

　　HGF对肝细胞癌的作用尚无定论，Tajima等[8]于1991年首次报道HGF能够抑制某些肝癌细胞株的增殖活性，HGF浓度达到1～10ng/ml时，肝癌细胞株HepG2的细胞增殖明显受到抑制。但Von等[9]观察到未被完全切除的肝母细胞瘤患儿术后4周内残余肿瘤生长迅速，与肝细胞最强的增生期相一致，同时伴有血清HGF的升高，这一现象提示残余肿瘤生长的加速可能与HGF分泌的增加有关。Miyazaki等[10]也观察到HGF对HUH-6细胞株有刺激生长的作用。到目前为止，体外实验研究表明外源性HGF既能抑制某些肝癌细胞株的增生(HepG2，Fao，HuH7)，又能促进另一些肝癌细胞株的增生(HuH6，Clone5)或对某些细胞株(HLE，HuH7，PLC5)无影响。有研究提示HGF对HCC细胞的作用与HCC细胞内HGF/c-Met依赖性信号传导通路的改变有关[2]，HGF对不同来源的人HCC细胞有不同的生长效应，也可能是因为不同细胞株中这一机制的改变存在差异所致，具体机制如何有待深入研究。

　　综上所述，本研究通过实时荧光定量PCR定量检测原发性肝癌、癌旁组织及正常肝脏组织中HGF mRNA的表达，并分析其与临床特征的关系，发现肝癌合并肝硬化患者HGF mRNA水平明显增高，虽然目前尚不清楚其准确分子机制，但本研究结果为今后进一步深入研究HGF 基因表达与原发性肝癌发生发展之间的机制奠定了有利的基础。

　　【参考文献】

　　[1]Tamatani T, Hattori Kiyer A. Hepatocyte growth factor is an invasion/migration factor of rat urothelial carcinoma cells in vitro [J]. Carcinogenesis,1999,20(6):957-962.

　　[2]Efimova EA, Glanemann M, Liu L, et al. Effects of human hepatocyte growth factor on the p roliferation of human hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines [J]. Eur Surg Res,2004,36(5):300-307.

　　[3]Uchida D, Kawamata H, Omotehara F, et al. Role of HGF/c-met system in invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells in vitro and its clinical significance [J]. Int J Cancer,2001,93(4):489-496.

　　[4]Yamagamim H, Moriyama M, Matsumura H, et al. Serum concentrations of human hepatocyte growth factor is a useful indicator for predicting the occurrence of hepatocellular carcinomas in C-viral chronic liver diseases [J]. Cancer,2002,95:824-34.

　　[5]许伦兵，耿小平，钱叶本.血清HGF水平与肝癌临床病理关系分析[J].肝胆外科杂志，2008，16(2)：137-140.

　　[6]罗运权，杨甲梅，陈汉，等.实验性大鼠肝脏癌变过程中HGF及其受体基因的表达[J].中华外科杂志，1999，37(3)：137.

　　[7]Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method [J]. Methods,2001,25(4):402-408.

　　[8]Tajima H, Matsumoto K, Nakamura T, et al. Hepatocyte growth factor has potent anti-proliferative activity in various tumor cell lines [J]. FEBS Lett,1991,291(2):229-232.

　　[9]Von Schweinitz D, Faundez A, Teichmann B, et al. Int-Hepatocyte growth-factor-scatter factor can stimulate post-operative tumor cell proliferation in childhood hepatoblastoma [J]. J Cancer,2000,85(2):151-159.

　　[10]Miyazaki M, Gohda E, Tsuboi S, et al. Human hepatocyte growth factor stimulates the growth of HUH-6 clone 5 human hepatoblastoma cells [J]. Cell B iol Int Rep,1992,16(2):145-154.