环氧化酶2抑制剂塞来昔布对胰腺癌荷瘤裸鼠的治疗作用

　　作者：刘江伟，张东辉，许永华，李开宗，窦科峰，张东，冯德元 作者单位：(1.解放军兰州军区乌鲁木齐总医院 肝胆外科，新疆 乌鲁木齐 830000;2.解放军第四军医大学西京医院 肝胆外科，陕西 西安 710032)

　　【摘要】目的 探讨环氧化酶2(COX2)抑制剂塞来昔布对胰腺癌荷瘤裸鼠的治疗作用。方法 构建胰腺癌荷瘤裸鼠模型, 将成瘤裸鼠随机分为4组，分别给予纯水(对照组)和含有不同浓度(0.05%、0.1%、0.15%)的塞来昔布饮水，观测裸鼠肿瘤生长情况并测量不同时间的体积变化，于治疗28 d 后处死裸鼠，测瘤体重量，应用caspase3试剂盒检测caspase3活性，免疫组织化学法检测肿瘤增殖指数(PI)和微血管密度(MVD) 。结果 治疗组裸鼠肿瘤体积的变化呈浓度依赖性和时效性;治疗28 d 后，治疗组瘤重量均明显低于对照组[(0.96±0.09)g、(0.78±0.06)g、(0.64±0.07)g vs (1.16±0.12)g ，P<0.01)] ;治疗组caspase3相对活性明显高于对照组(0.021±0.002、0.026±0.003、0.031±0.002 vs 0.006±0.001 ，P<0.01)。0.1%组、0.15%组的 PI和MVD均明显低于对照组 (P<0.05);0.05%组的PI和MVD虽均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 COX2抑制剂塞来昔布可显著抑制荷胰腺癌裸鼠的肿瘤生长，其作用机制可能是通过提高caspase3活性来诱导细胞凋亡，通过抑制肿瘤细胞的增殖和新生血管的形成来发挥抗肿瘤效应，在临床上具有潜在的应用价值。

　　【关键词】 胰腺肿瘤;环氧化酶2;塞来昔布;裸鼠

　　Therapeutic Effects of COX2 Inhibitor Celecoxib on Nude Mice Bearing Human Pancreatic Cancer Xenograft

　　Liu Jiangwei, Zhang Donghui, Xu Yonghua, Li Kaizon, Dou Kefeng, Zhang Dong, Feng Deyuan

　　(1. Department of Hepatobiliary Surgery, Urumqi General Hospital of Lanzhou Military Region, PLA, Urumchi 830000, China; 2. Department of Hepatobiliary Surgery, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, PLA, Xi’ an 710032, China)

　　Abstract： Objective To investigate the therapeutic effects of cyclooxygenase2 (COX2) inhibitor celecoxib on nude mice bearing human pancreatic cancer xenograft.Methods The nude mouse model of pancreatic cancer was established with human pancreatic cancer cell line BxPC3. The mice bearing tumor were randomly divided into four groups. Control group was provided with pure water, and trial groups were provided with water containing 500 ppm, 1000 ppm and 1500 ppm celecoxib, respectively. The tumor size and volume were measured at different time. The nude mice were sacrificed 28 days later after the beginning of the treatment. The weight of each tumor was weighed. The caspase3 activity was evaluated using a caspase3 assay kit, the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and microvessel density (MVD) were observed using immunohistochemistry. Results The tumor volume changed with doseand timedependent manner. The tumor weights were significantly smaller in the trial groups (celecoxib provided groups) than in the control group (0.96±0.09 g, 0.78±0.06 g, 0.64±0.07 g vs 1.16±0.12 g, P<0.01). The caspase3 activity was significantly higher in the celecoxib provided groups than in the control group (0.021±0.002, 0.026±0.003, 0.031±0.002 vs 0.006±0.001,P<0.01). The expressions of PCNA and MVD were significantly lower in 1000 ppm and 1500 ppm celecoxib provided groups than in the control group (P<0.05). The expressions of PCNA and MVD were lower in 500 ppm celecoxib provided groups than in the control group, but it is not significantly different (P>0.05).Conclusion The COX2 inhibitor celecoxib inhibits the growth of human pancreatic cancer in nude mouse model through activating the caspase3 activity to induce apoptosis and suppressing the proliferation and the angiogenesis of the pancreatic cancer cells. It may hold promise in the clinical treatment of pancreatic cancer.

　　Key words： pancreatic cancer; cyclooxygenase2; celecoxib; nude mouse

　　环氧化酶2(cycloxygenase2，COX2)是炎症过程中催化前列腺素合成的一个关键诱导酶。我们及其他学者先前的研究表明，COX2在胰腺癌组织中过表达，而在相邻的正常组织中不表达，COX2过表达与胰腺癌细胞的增殖、血管生成和细胞凋亡的抑制有关，与胰腺癌的发生、发展和预后密切相关[1～3]，COX2抑制剂塞来昔布(celecoxib)作用于胰腺癌BxPC3 细胞可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡并增加胰腺癌细胞对化疗的敏感性[4～5]，本研究旨在探讨塞来昔布对胰腺癌荷瘤裸鼠的治疗作用，以进一步探讨其抗肿瘤机制，为COX2抑制剂在治疗胰腺癌的临床应用提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　胰腺癌BxPC3细胞系购自第四军医大学口腔生物细胞培养库。塞来昔布(西乐葆，Celecoxib)，系辉瑞制药有限公司产品。鼠抗人PCNA 单克隆抗体为北京中山公司产品; 兔抗人FⅧRA g多克隆抗体和Envision二步法免疫组化试剂盒系DAKO 公司产品;caspase3 比色检测试剂盒系Calbiochem 公司产品. 所用BALB/C nu/nu遗传背景的裸鼠购于第四军医大学动物中心，选用4～6周龄、体重18～22 g 的雌性裸鼠28只，在兰州军区乌鲁木齐总医院动物中心SPF级条件下饲养。

　　1.2 细胞培养及裸鼠荷瘤模型的建立

　　胰腺癌BxPC3以含100 ml/L 的新生小牛血清(56 ℃，灭活30 min)、100 kU/L青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI1640培养基(Gibco公司)，在37 ℃，50 ml/L CO2饱和湿度条件下培养，每当2～3 d 换液传代，取对数期生长的细胞实验。至对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化后，收集制成108个/ml 的细胞悬液备用。将胰腺癌BxPC3细胞107混以0.1 ml PBS皮下注射于裸鼠背部，建立肿瘤模型。每只裸鼠取1个注射点，接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，按规定时间测量肿瘤体积，经过3～7 d 潜伏期，可见接种部位皮下出现灰白色结节，并逐渐长大，呈圆形或椭圆形，突出于体表，以肿瘤直径0.5 cm 为成瘤。

　　1.3 实验分组及处理

　　皮下接种7 d 后，有25只裸鼠成瘤，将其中24只裸鼠随机分为4组，每组6只。对照组为灭菌纯水，实验组设：塞来昔布0.05%组(0.5 mg/ml)、0.1%组(1 mg/ml)、0.15%组(1.5 mg/ml)，用灭菌蒸馏水溶解塞来昔布新鲜配制成溶液，供裸鼠每日自由饮水摄入。

　　1.4 检测指标和检测方法

　　每次在转染开始前用游标卡尺测量肿瘤大小1次，每5 d 1次，连续观测20 d，期间未出现裸鼠死亡，于第35天拉颈处死裸鼠，剥离皮下肿瘤，测量肿瘤长、短径，称瘤重量。肿瘤体积按公式V=3.14×a×b2/6计算，其中a为肿瘤的长径，b为短径，单位为mm。肿瘤标本部分快速投入液氮罐中，-80 ℃ 保存，部分组织用40 g/L中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm，以备免疫组化染色和HE染色用。

　　1.5 caspase3活性测定

　　取肿瘤组织20 mg，将组织团块加入1 ml 冰裂解液(50mmol/L HEPES，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，10 g/L CHAPS，pH 7.4)中10 min，4 ℃;13 000 g 离心10 min ，取上清液; 用Coomassie Reagent (Pierce)进行蛋白定量;100 μg 蛋白用裂解液稀释到40 μl;加入40 μl 反应缓冲液 (100 mmol/L NaCl，50 mM HEPES，10 mmol/L DTT， 1 mmol/L EDTA，10 g/L CHAPS，100 ml/L 丙三醇，pH 7.4) 和20 μl 比色标记的caspase3 底物 (AcDEVDpNA)，使终浓度为200 μmol/L，放入50 ml/L CO2 孵箱，37 ℃，4 h;用酶标免疫测定仪测定波长405 nm下的吸光度值来反映caspase3相对活性的吸光度。实验重复两次，caspase3相对活性用x±s表示。

　　1.6 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的检测

　　采用免疫组化SP法染色。鼠抗人PCNA单克隆抗体工作浓度1：50。PCNA蛋白表达以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每例切片计数至少10个400倍视野，以平均每1 000个细胞中所含阳性细胞的个数作为增殖指数(proliferating index，PI)。

　　1.7 肿瘤微血管密度(microvessel density，MVD)

　　采用免疫组化SP法染色，兔抗人FⅧ RA g多克隆抗体工作浓度1: 100。光镜下进行微血管计数并取其均值，方法如下: 每张切片先在低倍镜下(100倍)全面观察，确定5个血管密度最高热点，再在高倍镜下(<200倍)进行微血管计数。记录5个热点视野的微血管数， 取其均值作为该标本的MVD。

　　1.8 统计学方法

　　采用SPSS 10.0软件，进行作图和统计分析，均数比较用t检验.

　　2 结果

　　2.1 不同浓度的塞来昔布对胰腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制作用

　　应用经典的皮下肿瘤细胞注射方法建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，1周后可见裸鼠成瘤率89.29%。4组肿瘤体积的变化呈时间和塞来昔布剂量依赖性(图1)，在接种肿瘤的第35天，对照组、塞来昔布0.05%组、0.1%组和0.15%组肿瘤的平均体积分别为(703.56±12.51)mm3,(590.28±7.40)mm3，(491.97±4.62)mm3,(400.46±7.27)mm3,各塞来昔布组与对照组体积差异均具有显著统计学意义(P<0.01)，4组的平均瘤重量分别为(1.16±0.12)g，(0.96±0.09)g，(0.78±0.06)g，(0.64±0.07)g，各治疗组的平均瘤重量明显小于对照组 (P<0.01)，在饲养期间未发现裸鼠死亡及出现其他躯体的毒性反应。

　　2.2 不同浓度的塞来昔布对肿瘤组织caspase3活性的影响

　　对照组、塞来昔布0.05%组、0.1%组和0.15%组肿瘤的caspase3相对活性分别为0.006±0.001、 0.021±0.002、0.026±0.003、0.031±0.002，各治疗组的caspase3活性明显高于对照组，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 不同浓度的塞来昔布对肿瘤的细胞增殖和血管生成的影响

　　肿瘤的增殖指数(PI)和微血管密度(MVD)均随着治疗浓度的增加而逐渐降低，其中0.1%组和0.15%组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而0.05%组的PI和MVD与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 三组肿瘤的增殖指数、微血管密度和瘤重量(略)

　　3 讨论

　　环氧化酶2 (COX2) 在各种肿瘤中高表达，与促进肿瘤细胞的生长密切相关，COX2选择性抑制剂塞来昔布已被FDA批准用于家族性腺瘤性息肉的辅助治疗，其在肿瘤的预防和治疗中的作用已引起学者的广泛关注，成为近年来肿瘤研究的“热点”[6]。我们先前的研究发现[1～5]，COX2在胰腺癌组织中高表达，而在相邻正常组织中不表达，其高表达均与胰腺癌细胞增殖、血管生成、抗凋亡有关，我们曾将塞来昔布与顺铂联合作用于胰腺癌BxPC3，可明显抑制细胞的增殖，诱导细胞凋亡并增加胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性，本研究应用塞来昔布处理胰腺癌荷瘤裸鼠，进一步从体内试验证实，塞来昔布可呈剂量和时间依赖性抑制肿瘤的生长。可通过提高肿瘤caspase3 的活性以促进肿瘤细胞凋亡，实验组的增殖细胞核抗原(PCNA)和微血管密度(MVD)均明显高于对照组,表明塞来昔布在体内可通过抑制肿瘤细胞增生和抑制血管生成来发挥其抗肿瘤作用。

　　Pyrko 等[7]研究认为塞来昔布发挥抗肿瘤效应部分是通过下调survivin来实现，survivin是一重要的抗凋亡基因，被认为是肿瘤细胞生存的“看管者”。 Mcl1 是Bcl2 家族的抗凋亡成员，Mcl1的过表达可保护肿瘤细胞免受药物诱导的细胞凋亡[8]。根据我们先前研究发现[5]，塞来昔布作用于胰腺癌BxPC3后survivin和Mcl1的表达明显降低，而Bcl2的表达无明显变化，因而认为，COX2抑制剂诱导胰腺癌细胞凋亡的机制可能主要通过抑制survivin和Mcl1并进一步活化caspase3来实现的，caspase3是凋亡级联通路上的一个关键酶,可被 caspase8 和 caspase9通过死亡受体(Fas/Fas 配体系统) 或线粒体信号系统激活，因此所有的凋亡是通过激活caspase3 实现的。我们认为celecoxib主要通过提高caspase3活性来诱导胰腺癌细胞凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。

　　目前研究表明塞来昔布对肿瘤的抑制作用并非仅表现为COX2依赖途径，而且表现为COX2非依赖途径：主要通过减少G1S过程的主要检查位点DP1/E2F1复合物的形成来发挥G1S 细胞周期捕获;并通过PPARγ(过氧化物酶体增生物激活受体)的激活可抑制细胞生长;对提高caspase3和caspase9的活性也表现为COX2非依赖途径[9]。本研究发现塞来昔布可使肿瘤的微血管密度(MVD)明显降低，可见COX2在肿瘤血管生成过程中起重要作用，塞来昔布除了干扰细胞动力学以外，还可降低血管生成因子的表达，从而抑制肿瘤的血管生成，是塞来昔布发挥抗肿瘤作用的又一关键因素[10]。

　　尽管COX2抑制剂塞来昔布的抗肿瘤机制尚未完全阐明，我们的研究先后从体外和体内试验揭示了塞来昔布对胰腺癌的抗肿瘤效应，因塞来昔布抗肿瘤效应并不完全依赖于COX2途径，使其在抗肿瘤上具有更加广阔的应用前景，COX2抑制剂塞来昔布无论将来作为化疗药物或化疗辅助药物应用于临床，都必将成为人类抗肿瘤史上的一个“亮点”。

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　　[2] 刘江伟，李开宗，窦科峰，等. 胰腺癌组织中Survivin 和COX2表达相关性[J].第四军医大学学报，2004，25(7)：635-636.

　　[3] 文明波,姚红兵.环氧化酶2与消化道肿瘤研究进展[J].华南国防医学杂志,2006,20(1):33-37.

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　　[7] Pyrko P, Soriano N, Kardosh A, et al. Downregulation of survivin expression and concomitant induction of apoptosis by celecoxib and its noncyclooxygenase2inhibitory analog, dimethylcelecoxib (DMC), in tumor cells in vitro and in vivo[J].Mol Cancer, 2006,5:19.

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