肝细胞移植的临床应用前景

　　作者：陈钟 作者单位：(南通大学附属医院肝胆外科 南通大学肝胆外科研究所，南通226001)

　　【摘要】 动物实验和初步临床研究表明肝细胞移植有望成为肝衰竭或代谢性肝脏疾病治疗的一种有效手段。在临床广泛应用之前尚需解决肝细胞供体缺乏、肝细胞保存、移植肝细胞凋亡和如何有效促进受体肝细胞再生等问题。本文对肝细胞移植的临床应用有关问题进行了阐述。

　　【关键词】 肝衰竭;先天性代谢性疾病;肝细胞移植

　　肝细胞移植(hepatocyte transplantation, HTx)是将分离、培养的肝细胞植入体内，用于肝衰竭或代谢性肝疾病的治疗，肝功能的恢复或重建，促进自身肝再生而免于肝移植，或短期支持患者过渡到肝移植。HTx有望成为肝功能替代的一种有效手段。HTx具有如下优点：一肝多用，细胞来源较广，移植技术简单，即使移植失败对受体的影响也十分微小，因而受到越来越广泛的重视[1-2]。20世纪70年代初国外开始进行HTx的基础研究，1993年美国和日本开始进行实验性临床应用，1998年美国已批准临床应用肝细胞体内移植，十余年来肝细胞移植获得较大进展，在21世纪有很大的发展前景。

　　1 HTx的适应证

　　HTx的适应证包括：(1)各种原因所致的急慢性肝功能衰竭;(2)原发性肝脏遗传性疾病包括Crigler-Najjar综合征、苯丙酮尿症、家族性高胆固醇血症、α1-抗胰蛋白酶缺陷症、凝血因子Ⅶ、Ⅸ缺乏症、S和C蛋白缺乏症、遗传性果糖不耐受症、Wilson病、基因突变所致的脂蛋白代谢紊乱等等。

　　2 HTx的临床应用

　　2.1 移植细胞的选择 (1)人原代肝细胞 应用具有肝细胞功能最完善的人原代肝细胞是最理想的，但其来源有限，且体外培养增殖困难，肝细胞保存效果不太理想。因此长期拥有非常困难。胎肝细胞在体外可以扩增，也可在刺激下分化，免疫原性弱，但其来源受限，且存在伦理问题，临床很难推广; (2) 异种肝细胞 主要来自猪、犬、鼠、兔等实验动物。其来源广泛, 分离简便。其中猪肝细胞的应用最为广泛, 效果也最可靠[3]; (3)肝干细胞系：利用肝干细胞进行细胞移植，有望获得较好的疗效[4-6]。但肝干细胞分离技术尚未成熟; (4) 永生化肝细胞系 有学者以重组质粒SV40LT/pcDNA3.1经脂质体转染来源于正常人肝细胞，成功构建永生化人源性肝细胞系HepLL，研究表明HepLL具有正常人肝细胞的形态特征和生物学功能[7]。亦有学者转染SV40Tag基因来构建永生化肝细胞系。

　　2.2 移植肝细胞数量 要替代衰竭的肝脏功能，通常需要正常肝脏5%的细胞量，约107～109个肝细胞。

　　2.3 HTx部位选择 目前HTx的部位选择，主要有肝内移植、脾内移植、腹腔内移植等。肝脏本身的微环境及门静脉血中的营养成分，均对植入的肝细胞有益，门静脉内或肝实质内理论上应为供体肝细胞理想的植入场所。但实验发现HTx可引起门静脉力高压，重者导致广泛肝坏死，移植早期实验动物死亡率明显增加。这可能是由于植入的肝细胞直接阻碍受体肝脏的血液供应，引起肝脏的梗死和坏死，从而严重限制了肝细胞的植入数量。脾内移植是较适宜的部位，但脾脏仅能容纳不超过3%的正常肝组织，移植细胞量受限，且可引起门静脉高压。移植肝细胞可移位至肺内。脾内移植临床操作也是相当困难的，无论是开腹还是经皮脾穿刺，都有加重门脉高压和并发脾破裂之忧，移植细胞可以顺血流游走，引起肝栓塞，加重肝衰竭。腹腔内HTx，操作简单、创伤小、容量大、可反复进行[8]。但游离肝细胞腹腔内只能短期存活，移植细胞的血管化需要相对较长的时间，固定化肝细胞如微囊或胶原包裹肝细胞等方法可望解决这些问题[9]。微囊化方法与局部免疫抑制的结合可能是一种有价值的HTx策略。我们采用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子联合Ⅰ型胶原培养的异种肝细胞进行腹腔内HTx，7天后腹腔仍可见较多的存活肝细胞，发现纳米粒子有抗凋亡和抗免疫排斥反应的作用[10-11]。虽然腹腔内移植也可引起炎症反应和腹腔内感染，但这些可通过技术的改进而克服。HTx至体内其他部位如胰腺、肺脏、肾脂肪囊、皮下组织、肌肉等处，均有一定的代谢支持作用，但均不如腹腔内和脾脏内移植优越。

　　3 HTx初步临床试验结果

　　Fisher等[12]2006年总结了78例HTx的临床经验，认为其推广需要将较好的动物实验数据转变为临床资料。

　　3.1 肝衰竭 HTx的主要适应证为急性肝衰竭。当发生急性肝衰竭时即使在最好的医疗中心，也只有15%～25%的患者得以生存[13]，临床上急需新的肝移植之外的有效治疗方法[4]。Mito等[14]率先将HTx应用于肝衰竭患者的治疗，将107～6×108个肝细胞注射于患者脾脏，10例患者中，随访到9例，有8例放射性同位素显像示移植肝细胞存活1～11个月，患者临床症状改善。2003年Strom等[15]提出在肝功能不全时把HTx到肝脏或其它部位例如脾脏, 能够及时地起到支持肝功能的作用。他们还指出在临床上已经应用肝脏细胞移植作为整体器官移植的桥梁或替代治疗。Strom等[16]总结了美国6个中心18例接受HTx的肝衰竭患者，结果显示血氨和胆红素下降，肝性脑病好转，但未显示出整体治疗结果的好转。国内302医院共为7例肝衰竭患者实施了HTx，结果2例痊愈，2例好转，1例实施肝移植。

　　3.2 先天性代谢性疾病 Grossman等[17]1995年报道5例患家族性高胆固醇血症的患者接受HTx治疗，他们将同种肝细胞分离后用携带人LDL受体的病毒载体转录后移植到患者体内，结果5例4月后均有转录后基因表达，3例血LDL水平下降达20%。Strom等[18]将HTx用于先天性肝脏代谢缺陷性疾病的治疗。1例先天性鸟氨酸转酞酶缺乏引起的尿素代谢紊乱患者，HTx后临床症状缓解，遗憾的是该患者42天后死于肺炎;1例先天性抗胰蛋白酶缺乏的患儿，移植时活检证实存在肝硬化，HTx后成功的进行了肝移植;另1例为先天性Crigler-Najjar综合征Ⅰ型患者，经皮门静脉穿刺3次，共输入7.5×1010个肝细胞，该患者HTx后18个月仍健在。Sokal等[19]报道1例患有Refsum病的幼儿在接受了大约2×109个细胞HTx后，生化指标得到明显改善。

　　4 临床应用中存在的问题

　　关于HTx的临床应用需要进一步设计前瞻性大样本随机临床研究。作为肝移植的桥梁及替代手段，肝细胞移植临床应用中仍存在一些急待解决的问题。(1)肝细胞供者缺乏。尽管细胞分离培养技术已日臻成熟，但在目前技术条件下，肝细胞仍只能原代培养，尚不可能对其进行扩增，因此仍存在供肝不足问题;(2)肝细胞保存与复苏困难。最近，Koizumi等[20]利用包胶囊法深低温保存鼠肝细胞，发现能够长期保持鼠肝细胞的药物代谢功能。任何冻存方法的最终目的是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形成,从而保持解冻后细胞活性、黏附能力及代谢活性。人肝细胞的冻存目前尚没有一个标准的方法，国内外研究者积极致力于此领域的探索. 肝细胞与基质、肝细胞与非实质细胞的接触对肝细胞的生长和活性也起着极为重要的作用[21];(3)移植肝细胞的凋亡。凋亡是肝细胞移植成功的最大障碍，但其发生的机制尚不甚清楚，一般认为与免疫排斥反应有关。移植肝细胞只有具有竞争性生长优势才能整合到宿主肝脏组织，存活、增殖，形成再生结节，否则易被宿主免疫系统排斥，逐渐凋亡。微弱免疫原性的存在使移植肝细胞易受宿主免疫系统的攻击，处于生长劣势，影响其临床应用的疗效。消除同种异体肝细胞移植免疫排斥反应的方法，包括降低移植肝细胞的免疫原性，诱导免疫耐受或者使用免疫抑制剂。利用特种肝细胞(如基因修饰的肝细胞)，可以纠正先天性肝脏酶缺乏病实验动物的相关指标[22]。目前，国内外学者已进行了大量的相关实验研究，但目前仍处于探索阶段，离临床应用仍有一段距离;(4)受体肝再生。HTx的主要目的之一是促进受体肝再生，在这方面还期待更深入的研究，载药纳米技术的应用有望取得突破。总之，HTx作为肝脏终末性疾患，进行肝移植治疗的桥梁或替代手段具有广阔的临床应用前景。国内外已在基础研究中积累了宝贵的经验，并对临床应用进行了卓有成效的探讨。HTx部位的选择尚存在争议。HTx供者缺乏及移植肝细胞的凋亡，如何有效促进肝再生是HTx临床应用中急待解决的问题。

　　5 展 望

　　动物实验和临床试验已证明HTx可有效地替代肝衰竭及代谢性肝疾病的肝脏功能，即将进入临床。我国尤其我省肝病发病率较高，其治疗仍是临床一大难题。相信随着细胞生物学，组织工程学的发展和研究的深入，HTx将成为肝病患者的一种有效和重要的治疗手段。

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