头孢地嗪对免疫性肝损伤小鼠外周血T细胞亚群的影响

　　作者：王鹏，阚全程，余祖江 作者单位：郑州大学第一附属医院，河南郑州 450052

　　【摘要】 目的观察头孢地嗪对免疫性肝损伤小鼠外周血T细胞亚群的调节作用。方法 采用卡介苗联合脂多糖诱导法建立免疫性肝损伤的小鼠模型;将造模成功的免疫性肝损伤小鼠随机分为胸腺肽组、头孢地嗪大、中、小剂量组、头孢曲松组和生理盐水组，连续给药7 d，同时以正常小鼠作为对照组;采用免疫荧光染色技术，经流式细胞仪对小鼠的外周血T细胞亚群进行检测。结果 免疫性肝损伤合并败血症小鼠的CD3+(%)、CD4+(%)和CD8+(%)均明显低于正常小鼠，而头孢地嗪可有效地提高免疫性肝损伤合并败血症小鼠的CD3+(%)、CD4+(%)和CD4+/CD8+。结论 头孢地嗪可通过调整CD4+和CD8+之间的平衡，有效地提高机体的免疫功能。

　　【关键词】 头孢地嗪;免疫性肝损伤;T细胞亚群

　　Effects of cefodizime on the T-lymphocyte subsets ofperipheral blood in mice with immunological liver injury

　　Wang Peng, Kan Quancheng, Yu Zujiang

　　(the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the regulatory effect of cefodizime on the T-lymphocyte subsets of peripheral blood in mice with immunological liver injury. Methods The mouse model of immunological liver injury was induced by Bacillus Calmette Guerin and Lipoposaccharide. The study was conducted by using completely random design. The mice with immunological liver injury were divided into thymosin group, cefodizime high-, medium-, low-dose groups, ceftriaxone group and the normal saline group. The six groups were continuously administered agents respectively for 7 days, and T-lymphocyte subsets of peripheral blood in mice were determined and contrasted with those of the normal mice treated with normal saline on the 7th day. Flow cytomytry was used to determine the effects of cefodizime on T-lymphocyte subsets of peripheral blood in mice by using immuno-fluorescence technique. Results The immunological liver injury mice were deficient because their CD3+(%), CD4+(%), CD8+(%) and the ratio of CD4+/CD8+ were lower than those of the normal mice. Cefodizime effectively increased CD3+(%), CD4+(%) and the ratio of CD4+/CD8+ of the mice with immunological liver injury. Conclusion Cefodizime effectively improves the immune function of the host by regulating the balance between CD4+ cell and CD8+ cell.

　　KEY WORDS: cefodizime; immunological liver injury; T-lymphocyte subset

　　宿主的免疫反应在病毒性肝炎的肝脏损伤中发挥着重要的作用[1-2]。肝炎患者的免疫状态与病情密切相关。在发生重型肝炎时，由于机体抵抗力低下，肠黏膜通透性增加等因素易导致细菌移位，发生感染[3-4]。因此，感染是重型肝炎患者的重要合并症，而败血症是重型肝炎患者死亡的一个重要原因[5]。

　　头孢地嗪(cefodizime, CDZM)是广谱高效的新型第3代头孢菌素。研究发现，CDZM具有明显的免疫调节功能，这是其他抗生素所不具备的[6]，临床应用前景广阔。目前CDZM对免疫性肝损伤动物模型的免疫调节作用在国内外尚未见报道。本研究采用流式细胞术检测免疫性肝损伤小鼠外周血T细胞亚群，观察CDZM对机体免疫功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康昆明种小鼠，♀，4-5周龄，体重(20±2)g，购自河南省实验动物中心(动物许可证号：410115)。动物自动觅食、饮水。

　　1.2 试剂与仪器

　　①试剂：CDZM(1.0 g/支，山东鲁抗医药集团鲁亚有限公司，批号：040317);头孢曲松(ceftriaxone，CRO，2.0 g/支，海南通用三洋药业有限公司，批号：040301);胸腺肽(thymosin，Thy，50 mg/5 mL，吉林玉皇药业有限公司，批号：20040715);流式细胞检测剂(100T，北京市晶美基因谷科技有限公司，批号：SL140411);荧光素异硫氰酸标记的抗小鼠CD4(FITC-CD4)、藻红蛋白标记的抗小鼠CD3(PE-CD3)、荧光素藻红蛋白-青色素标记的抗小鼠CD8(PE-CY5-CD8)及相应荧光标记的同型阴性抗体FITC-IgG2b、PE-IgG、PE-Cy5-IgG2a均为美国eBioscience公司产品;脂多糖(lipoposaccharide，LPS，Sigma公司，批号：B-L2880-1)，使用前用无菌、无热原的生理盐水(NS)配制成50 mg/L的溶液;卡介苗(bacillus calmette guerin, BCG，约5×106个活菌/mg，上海生物制品研究所，批号200406001)，使用前将50 mg BCG经10 mL无菌、无热原的NS稀释为2.5×107个活菌/mL的BCG悬液;丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(赖氏法，批号：20041101，上海申索试剂有限公司、上海生物制品研究所联合生产)。②仪器：JY-B型快速旋涡混匀器，姜堰市康健医疗器具厂;80-2型离心机，上海手术器具厂生产;FACScan型流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司;721-100型分光光度计，上海第三分析仪器厂。

　　1.3 方法

　　1.3.1 免疫性肝损伤模型的建立

　　经小鼠尾静脉注射已配制的BCG悬液0.2 mL/只(约5×106个活菌/只)，连续注射12d后，尾静脉注射LPS 7.5 μg/只进行攻击，以诱导肝损伤，16 h后，随机选出6只小鼠，断头处死，采集血样，测定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，同时取出肝脏，供病理学检查。

　　1.3.2 动物分组及处理

　　正常对照组：健康小鼠13只，NS0.2 mL/只，首先尾静脉注射13 d后，随机选出6只小鼠，断头处死，采集血样，测定小鼠血清ALT，同时取出肝脏供病理检查。剩余7只小鼠改为腹腔注射法，连续给药7 d。BCG+LPS组：将造模成功的免疫性肝损伤小鼠随机分为6组，每组20只。NS组：NS 0.2 mL;CRO组：CRO 500 mg/kg;Thy组：Thy 10 mg/kg;CDZM小剂量组：CDZM 50 mg/kg;CDZM中剂量组：CDZM 200 mg/kg;CDZM大剂量组：CDZM 500 mg/kg。

　　各实验组均采用腹腔注射给药法，连续给药7 d。第7天给药3 h后断头采血，肝素抗凝后，进行T细胞亚群测定，并于12 h内测定完毕。

　　1.3.3 T细胞亚群测定

　　取两组试管，分为实验管和阴性对照管。每支实验管中均加入FITC-CD4、PE-CD3、PE-Cy5-CD8，其阴性对照管中均加入相应的同型对照抗体FITC-IgG2b、PE-IgG、PE-Cy5-IgG2a。每份抗凝全血分别加入实验管和阴性对照管各50 μL，混匀机混匀，避光保存25min;加入流式细胞检测剂2 mL，混匀机混匀，再次避光保存15 min后;1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS缓冲液1 mL，混匀;1 500r/min离心5 min，弃上清。反复2-3次后，加PBS至0.5 mL，混匀后，流式细胞仪进行检测。

　　1.3.4 统计学处理

　　各实验组小鼠外周血的CD3+(%)、CD4+(%)、CD8+(%)、CD4+/CD8+检测结果经CELLQuest软件进行分析记录，并经SPSS10.0统计软件对其进行多个样本的方差齐性检验和单因素方差分析后，进行多个样本均数间的最小显著差t检验(LSD-t检验);小鼠血清ALT活性测定的实验数据进行方差齐性检验后，采用两样本均数比较t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 血清ALT活性

　　实验组的ALT活性为(77.28±7.78)Karmen U，而正常对照组的ALT活性仅为(15.55±3.22)Karmen U，实验组的ALT活性明显高于正常对照组(P<0.01)。

　　2.2 肝脏组织病理学变化

　　正常对照组：小鼠肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构清晰，汇管区无炎性细胞浸润;胞核圆，核膜清晰，核仁明显(图1A)。BCG+LPS组：小鼠肝索排列紊乱，肝窦被挤变窄或不明显;肝细胞变性明显，可见细胞浊肿、颗粒变性、气球样变，胞质疏松化及灶状坏死，严重的呈片状坏死，汇管区可见大量以淋巴细胞和单核细胞为主的炎症细胞浸润，可见血管扩张，充血，多见片状坏死(图1B)。结果表明，免疫性肝损伤小鼠模型建立成功。

　　2.3 CDZM对免疫性肝损伤小鼠T细胞亚群的影响

　　典型T细胞亚群的流式细胞分析图像见图2。Thy组、CDZM大、中、小剂量组的CD3+(%)、CD4+(%)、CD8+(%)、CD4+/CD8+之间均无差异，其中Thy组、CDZM中、小剂量组的CD3+(%)明显高于CRO组和NS组，而低于正常对照组(P<0.05);CDZM大剂量组的CD3+(%)明显高于CRO组和NS组(P<0.05)，与正常对照组之间无差异;CRO组和NS组的CD3+(%)明显低于正常对照组(P<0.05)。Thy组、CDZM大、中、小剂量组及正常对照组的CD4+(%)之间均无差异，但均明显高于CRO组和NS组(P<0.05)。BCG+LPS组的6组之间的CD8+(%)均无差异，但都明显低于正常对照组(P<0.05)。Thy组、CDZM大、中、小剂量组的CD4+/CD8+之间无差异，但均明显高于CRO组、NS组和正常对照组(P<0.05)，CRO组、NS组和正常对照组的CD4+/CD8+之间无差异。CRO组和NS组之间各项指标均无差异(表1)。表1 头孢地嗪对免疫性肝损伤小鼠T细胞亚群的影响(略)

　　3 讨论

　　3.1 给药剂量的选择

　　在本实验中CDZM 50 mg/kg的剂量为国外文献小鼠常采用的CDZM实验用量[7]，而CDZM 200 mg/kg和CDZM 500 mg/kg的量是根据人体常用量30-60mg/kg按小鼠体重根据公式db=da×Rb Ra×3 Wa Wb折算所得[8]，同理，Thy和CRO剂量也是按照人体常用量折算所得。根据药物临床常用剂量折算而得小鼠用药量，更能准确评价常规治疗剂量下CDZM对人体的免疫调节作用[9]。

　　3.2 免疫性肝损伤小鼠模型的选择与建立

　　有关肝炎病毒研究的实验方法一直是个难题，例如人HBV病毒的宿主范围狭窄，具有很强的种属特异性与组织特异性，主要感染人和少数高等灵长类动物如大猩猩，而在组织培养上HBV病毒增殖未获成功，体外传播系统一直没有建立[10]，因此缺乏合适的肝炎病毒感染动物模型[11]。由于免疫系统在肝炎、肝硬化及药物性肝脏损伤等的发病过程中发挥着重要作用，因而采用建立在病理生理机制上更接近于人类肝炎的免疫肝损伤的动物模型进行研究是十分必要的。BCG联合LPS诱导法成功率高，操作简单，被认为是研究肝炎发病和治疗较理想的模型之一[8]。但是人类肝炎是许多致病因子引发的，而BCG+LPS所致的急性免疫性肝损伤动物模型只能近似地模拟肝炎的功能、肝脏组织病理改变及部分的发病机制[12]。ALT作为重要的炎症指标，病毒性肝炎患者常出现ALT的升高[13]，而本研究利用BCG联合LPS诱导法来建立免疫性肝损伤模型，结果表明免疫性肝损伤组小鼠血清ALT活性显著增高，与正常对照组比较有显著性差异，并且肝脏病理学改变明显，与文献报道一致[14]。证明BCG联合LPS建立小鼠免疫性肝损伤模型是成功的。

　　3.3 CDZM对小鼠外周血T细胞亚群的影响

　　肝炎患者免疫状态与病情密切相关，CD3+细胞减少,表明机体参与细胞免疫反应的免疫活性细胞不足;CD4+/CD8+的比值下降,代表免疫平衡失调,会导致自身组织受损害,发生肝细胞损伤。CD8+是导致大量肝细胞坏死的主要因素，在重型肝炎的发病机制中发挥着重要作用;有研究发现各型肝炎肝脏浸润的细胞主要为T细胞，在肝细胞坏死区以CD8+和巨噬细胞为主，其数量与病情的严重程度有关[15]。这些研究为CD8+细胞可造成肝脏免疫损害提供了直接的证据。

　　但是，CD4+和CD8+在病毒性肝炎患者表现各异。闫峻等[16]研究发现，慢性病毒性肝炎患者外周血CD4+、CD4+/CD8+比值明显降低，CD8+增高，并且随着病情加重，变化更为明显。而张敏等[17]研究发现，与正常人相比，肝炎肝硬变者CD8+的比例和绝对数降低，而CD4+无显著性变化，CD4+/CD8+升高。这表明患者体内存在细胞免疫缺陷，因而病毒不能被清除，与病毒感染的慢性化有关;B细胞的比例和绝对数升高，证实患者体液免疫亢进;NK细胞绝对数下降，证明患者非特异性细胞免疫功能不足[18]。而肝炎肝硬变患者发生合并细菌感染组的CD3+、CD4+、CD8+的绝对数均低于非感染组，认为CD4+、CD8+减少与部分肝炎患者更易患细菌感染有关。同样张卫国等[19]的研究发现，肝硬化患者外周血CD3+(%)、CD4+(%)、CD4+/CD8+较正常人明显降低，认为这是患者体内肝炎病毒长期存在，不易被清除，病情持续恶化，易合并感染的重要原因。这些研究结果说明病毒性肝炎患者存在严重的免疫功能紊乱，即使是无症状的HBV携带者,T细胞亚群亦有变化。

　　综上所述，本研究结果表明免疫性肝损伤小鼠的CD3+(%)、CD4+(%)和CD8+(%)均明显低于正常小鼠，导致免疫功能低下。而与Thy相似，CDZM也可有效地提高CD3+(%)、CD4+(%)和CD4+/CD8+值，从而提高机体的免疫功能，增强机体的抵抗力。CDZM在临床上既能有效地抗感染，又能充分地调动机体的免疫调节功能，为病毒性肝炎的临床诊断和免疫治疗提供了新的思路和方法。

　　【参考文献】

　　[1]Yoneyama H, Harada A, Imai T, et al. Pivotal role of TARC, a CC chemokine, in bacteria-induced fulminant hepatic failure in mice [J]. J Clin Invest,1998, 102(11):1933-1941.

　　[2]Tsuji H, Mukaida N, Harada A, et al. Alleviation of lipopolysaccharide-induced acute liver injury in propionibacterium acnes-primed IFN-gamma-deficient mice by a concomitant reduction of TNF-alpha, IL-12, and IL-18 production [J]. J Immunol, 1999, 162(2):1049-1055.

　　[3]刘昌，张晓刚，于良，等. 肝移植术后重症监护病房细菌感染的临床研究 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(1):93-95.

　　[4]何建秀，谢毅生，付晓梅，等. 重型肝炎并发细菌性腹膜炎病人治疗前后心钠素、肿瘤坏死因子含量的变化 [J]. 中国基层医药, 2004, 11(5):578-580.

　　[5]任星峰，葛娅，靳桂明. 重症肝炎并发自发细菌性腹膜炎临床特点分析 [J]. 中华医院感染学杂志, 2001, 11(1):13.

　　[6]Hamilton-Miller JM. Immunopharmacology of antibiotics: direct and indirect immunomodulation of defence mechanisms [J]. J Chemother, 2001,13(2):107-111.

　　[7]Limbert M, Bartlett RR, Dickneite G, et al. Cefodizime, an aminothiazolyl cephalosporin. IV. Influence on the immune system [J]. J Antibiot(Tokyo), 1984, 37(12):1719-1726.

　　[8]徐叔云,卞如濂,陈修. 药理实验方法学 [M]. 第三版.北京：人民卫生出版社, 2002:1348-1350.

　　[9]陈雪华,何礼贤,胡必杰,等. 头孢地秦在免疫抑制小鼠白念珠菌败血症中的作用 [J]. 上海免疫学杂志, 2000, 20(2):81-84.

　　[10]Guidotti LG. The role of cytotoxic T cells and cytokines in the control of hepatitis B virus infection [J]. Vaccine, 2002, 20:80-82.

　　[11]刘敏，张伟，陈天艳，等. 丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(1):20-22.

　　[12]邱英锋,缪晓辉,王俊学,等. 卡介苗加脂多糖建立大鼠急性免疫性肝损伤模型的研究 [J]. 实验动物科学与管理, 2004, 21(3):15-19.

　　[13]晁萍，张梅喜，刘宗文，等. HBV携带者ALT升高因素分析 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2002, 37(1):99-101.

　　[14]罗洋，郝飞，王宇明，等. 自身免疫性肝炎小鼠动物实验模型的建立 [J]. 中华肝脏病杂志, 2001, 9(6):358-360.

　　[15]Kakumu S, Fukatsu A, Shinagawa T, et al. Localisation of intrahepatic interleukin 6 in patients with acute and chronic liver disease [J]. J Clin Pathol, 1992, 45(5):408-411.

　　[16]闫峻,申吉子,李东复. 慢性病毒性肝炎患者血清IL-12水平、T细胞亚群变化及相互关系的研究 [J]. 吉林医学, 2002, 23(6):346-347.

　　[17]张敏，于海波，王福生，等. 乙型肝炎肝硬变患者淋巴细胞亚群的特点及其与细菌感染的关系 [J]. 军医进修学院学报, 2004, 25(3):227-228.

　　[18]Jason J, Archibald L, McDonald LC, et al. Immune determinants of organism and outcome in febrile hospitalized thai patients with bloodstream infections [J]. Clin Diagn Lab Immunol, 1999, 6(1):73-78.

　　[19]张卫国，吴清明，王小虎，等. 脾栓塞对肝硬化患者外周血T淋巴细胞亚群的影响 [J]. 临床消化病杂志, 2003, 15(5):203-211.