大鼠酒精性肝病模型的建立

　　作者：赵初环 卢中秋 李惠萍 吴斌 李景荣 胡国新 作者单位：325000 温州医学院附属第一医院(赵初环、卢中秋、李惠萍、吴斌、李景荣)　325000 温州医学院药理研究室(胡国新)基金项目：浙江省科技厅科研基金资助项目(2005C30009)温州市科技局重大计划项目资助(Y2004A004)

　　【摘要】 目的 探讨白酒灌胃联合自由饮酒法建立大鼠早期酒精性肝病模型的意义，以便找到一种发病机制、病理改变均与临床接近且周期较短的方法来制作大鼠酒精性肝病模型。方法 模型组采用52%二锅头白酒配置成40%、45%、50%浓度，分别灌胃4、4、2周，第11周起改用自由饮酒(浓度50%);对照组前10周用等容生理盐水灌胃，第11周起自由饮水。12周后测定大鼠血清ALT、AST、白蛋白、白球比例，观察大鼠肝脏的组织学和超微结构改变。结果 12周后，模型组大鼠血清AST较正常对照组明显增高，白蛋白水平、白球蛋白比例明显下降，肝脏组织有炎症、坏死和轻微脂肪变性、纤维化。结论 白酒灌胃联合自由饮酒法是建立大鼠慢性酒精性肝病模型的一种可靠稳定方法，将为酒精性肝病的相关研究打下良好的实验室基础。

　　【关键词】 大鼠 酒精性肝病 动物模型 灌胃

　　【Abstract】 Objective To induce a relatively simple and feasible rat model of alcoholic liver disease by the freely drinking and perfusing stomach with alcohol, which is close clinical situation and timesaving . Methods Rat model of alcoholic liver disease was induced by the freely drinking and perfusing stomach with alcohol .The rats were intragastric administratered in first with a special amount of alcohol receiving alcohol drinking water as the sole source of liquid. The alcohol concentration was increased from 40%( alcohol /water: v/v)to 45% and to a final concentration of 50% for 4,4,2 weeks by a tube everyday .Then the modal group drank alcohol freely from the 11th week .In the control group, rats were intragastric administratered with equal NS in early 10 weeks,and drunk water freely from the 11th week. After 12 weeks, almandine aminotransferase (ALT), aspartateaminotransferase(AST), albumin(ALB),albumin/globulin(A/G) of rats drinking and perfusing stomach with alcohol were detected and were compared with those of the control rats.Used t -test for comparative method of two sample means. And the liver tissues were observed both in light microscope(LM) and electron microscope(EM). Results After 12 weeks, AST of rats drinking and perfusing stomach with alcohol were increased, ALB and A/G were decreased, compared with those of the normal rats, and alcohol hepatitis were aggravated and fibrosis were observed in pathology and ultrastucture. Conclusions These results demonstrate that the alcohol liver disease model we used is stable and can be used in study of ALD.

　　【Key words】rats alcohol liver disease(ALD) animal model intragastric administration

　　对酒精性肝病的相关基础研究，必不可少的是要制作酒精性肝病动物模型。在我国以往多用四氯化碳腹腔或皮下注射造成鼠肝类似酒精性肝病的病理改变，但从发病机制、病程演变过程及最终组织形态学改变来看，与酒精性肝病均有较大的差异，且四氯化碳毒性大，易导致中毒死亡;也有采用给鼠做胃造瘘，经造瘘管注入酒精制作酒精肝模型，但该法操作难度相对较大，成功率不高。作者采用白酒灌胃联合自由饮酒法制作大鼠酒精肝模型[1，2]，操作简便，成模时间短，成功率较高。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　体重125～155g雄性SD大鼠60只 (本校实验动物中心提供)，环境温度18℃～20℃，湿度70%左右，自由采食全价营养颗粒饲料，垫料为紫外线消毒后的卫生纸。将酒精体积分数为0.52的红星二锅头白酒(北京酿酒总厂生产)，按体积比分别稀释成40%、45%、50%(v/v)备用。

　　1.2 动物模型的建立

　　60只大鼠随机分为模型组和正常对照组。模型组(n=54)按每周所测得的体重给予每日早晚白酒灌胃各1次。第1周将稀释成40%的白酒按剂量4g/(kg·d)、每次0.5ml/100g灌胃，第2周按剂量8g/(kg·d)、每次1.0ml/100g灌胃，第5周开始将稀释成45%的白酒按剂量9g/(kg·d)、每次1.0ml/100g灌胃，第9周将稀释成50%的白酒按10g/(kg·d)、每次1.0ml/100g灌胃，第11周起改用自由饮酒至第12周,以浓度50%白酒作为主要饮料，日供给量40ml，同时限制饮水。正常对照组(n=6)大鼠前10周每日用等容生理盐水灌胃，第11周起自由饮水。各组大鼠实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食，前10周自由进水。第12周末随机抽取模型组大鼠与正常对照组大鼠各4只，从颈动脉采集血标本，后行放血法处死，造模组处死时距最后一次饮酒时间24h。大鼠处死后立即取出肝脏，称重量后留取小块组织以电镜液固定，大体以10%的福尔马林液固定，石蜡包埋，HE染色行组织病理学观察，血标本用于测定生化指标。

　　1.3 观察指标及测定方法

　　定期观察大鼠精神状态、活动情况及毛发光泽度、食欲、大小便情况等。所有大鼠每周称体重1次，处死后肉眼观察肝脏的外形、大小、色泽、质地、切面情况,并称重量。HE染色观察肝脏病理学改变(肝细胞变性、坏死,炎细胞浸润等)，同时测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(AP)、球蛋白(GP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。

　　1.4 统计学分析

　　采用t检验，进行两样本均数比较。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　实验过程中模型组24只大鼠死亡，其中多系灌胃时酒精误入气管及急性胃扩张所致，正常对照组无一例死亡。模型组大鼠酒精灌胃初期，均出现流涎、体态呆板、嗜睡、精神萎靡、食欲减退和行动迟缓等现象(6～7周后减轻)，毛发光泽度差，体重增长缓慢，其中4只大鼠出现鼻。正常组大鼠毛发有光泽，体态活泼，食量及大便正常，无嗜睡现象。实验12周末，模型组大鼠体重(474.4±46.89)g，对照组大鼠体重(527.20±25.79)g，两组比较，差异有显著性(P<0.05)。肝脏标本大体观察：正常对照组大鼠肝脏被膜光滑，呈红褐色，质地软;模型组大鼠肝脏色泽较正常肝脏暗淡，但表面仍光滑，未见结节及灶状改变，肝缘略变钝，质地尚软。两组大鼠腹腔内均无腹水，脾正常大小。

　　2.2 肝组织病理学改变

　　HE染色，对照组标本见正常肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，模型组大鼠肝脏病理改变为肝脏汇管区血管及中央静脉高度扩张充血，部分区域见轻度纤维化，汇管区见淋巴细胞浸润，部分区域淋巴细胞较多，肝细胞明显水肿，部分区域气球样变。

　　2.3 肝功能变化

　　模型组大鼠AST(281.00±47.72)U/L，明显高于正常对照组的(188.50±32.12)U/L，差异有显著性(P<0.05)，A/G 0.38±0.05，明显低于对照组的0.58±0.17，差异有显著性(P<0.05);ALT(49.50±16.81)U/L，对照组(47.75±11.82)U/L差异无显著性(P>0.05)。

　　2.4 肝脏超微结构改变

　　电镜观察显示，模型组大鼠肝细胞核仁边集，核膜迂曲，核内染色质团块状凝集，核周间隙扩张，细胞质疏松、破坏、溶解，线粒体增生、肿胀，肝细胞间和窦状隙可见白细胞浸润，少数肝细胞内局灶性溶解(图1)。对照组大鼠肝细胞核呈圆形或类圆形，核仁位于核中央或近中央区,核内染色质分布均匀，胞浆内无或仅有少量脂滴。两组均未见狄氏隙胶原纤维增生。

　　3 讨论

　　目前对酒精性肝病的相关基础研究，一般是通过在动物体内构造出与人类相似的病理实验模型。国内外已有多位学者在该领域进行了研究，并创建了多种模型如Lieber-Decarli模型、Tsukamoto-French模型、Lieber-Decarli液体食料加辅剂模型[3～5]等。Lieber-Decarli模型、Tsukamoto-French模型是按摄入总热量的一定比例来确定摄食酒精量，不符合正常酒精摄入情况，同时Tsukamoto-French模型需一些特殊技术及设备，而Lieber-Decarli液体食料加辅剂模型与生理情况不符。国内多采用酒精灌胃[1，2，6，7]等模型。白酒灌胃法是诱导大鼠急性酒精性肝损伤的一种常用方法，符合人的饮酒途径，方法简便易行。实验发现，采用白酒灌胃法建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型，大鼠死亡数较多，尤其在快速增加灌酒量时，大鼠死亡更加严重，这与白酒灌胃有直接关系，少数大鼠的死亡可能与灌酒引起的急性肝脏和胃损伤有关。降低大鼠死亡数的最好方法是减少灌酒量，或降低灌酒的浓度，但是，这对建立模型不利。因此，在大鼠可以耐受的情况下，使其摄入较多的乙醇是白酒灌胃法建立大鼠酒精性肝病模型的关键。文献报道，白酒灌胃联合高脂饲养喂饲4周时可见轻度酒精性肝炎和酒精性脂肪肝的病理改变,12周时酒精性肝炎改变加速并出现纤维化，而未采用高脂饲养喂养造成纤维化模型周期长达24周，故作者采用适当提高酒精量的同时，采用非高脂饲料喂养12周这一方法来进行生化病理观察。

　　本实验模仿人类慢性酒精中毒情况，在喂饲固体饲料的同时，给大鼠胃内灌入浓度递增的白酒，剂量从4g/(kg·d)至10g/(kg·d)递增，在达到一定的浓度后改用自由饮酒，于12周时观察到了酒精性肝病病理改变，造模时间明显短于周宁等[2]报道的时间。12周后，测得对照组大鼠血浆AST为(188.50±32.12)U/L，略高于周宁等[2]报道的正常对照值(152.00±18.42)，明显高于正常大鼠血浆AST参考值(以30日龄时78U/L为对照)，这可能与大鼠喂养时间长、喂养方法不同及测定方法差异等有关。模型组血浆AST为(281.00±47.72)U/L，明显高于对照组，说明灌酒使大鼠肝细胞发生损伤。转氨酶是肝细胞损伤最敏感指标之一，长期大量饮酒导致慢性肝细胞变性，直接损伤线粒体，位于线粒体内的AST渗漏入血。模型组A/G比值下降，亦说明灌酒能损伤大鼠肝细胞。酒精引起肝细胞受损时，乙醇代谢产生的乙醛影响蛋白质转运和分泌，使蛋白性物质潴留的同时也吸收水分，因此肝细胞水肿，炎性细胞浸润，白蛋白合成降低，球蛋白浓度反而增高，导致A/G下降。肝脏组织学观察发现模型组大鼠肝脏出现脂肪变性、炎症和轻度纤维化，电镜观察进一步证实模型组大鼠肝脏的超微结构改变，因此，无论在血浆肝细胞损伤的生化参数方面还是在肝脏组织学方面，白酒灌胃法均能引起大鼠类似人类早期酒精性肝病的变化，所以白酒灌胃法是建立大鼠早期酒精性肝病的一种可靠方法。使用普通饲料造模成功还表明，酒精对肝细胞有直接毒性作用，实验过程中发现在实验开始的第5至10周模型组大鼠死亡数较高，达44.4%(24/54)，对照组为0，而在改用自由饮酒后存活大鼠均无死亡发生。所以，作者认为剂量递增白酒灌胃联合自由饮酒比单纯白酒灌胃更为可取，模型接近国人的饮酒习惯，且造模方法简便易行、费用低。本模型的建立将为酒精性肝病的相关研究打下良好的实验室基础;但如何进一步降低死亡率，提高造模成功率仍有待更深入地探讨。

　　【参考文献】

　　1 孙怡宁,尚荣军,罗金燕，等.白酒灌胃法建立大鼠早期酒精性肝病模型.陕西医学杂志,2002,32 (6):565～567.

　　2 周宁，厉有名，张宇，等.大鼠酒精性肝纤维化模型的构造.东南大学学报(医学版)，2003，22(2)：93～97.

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　　5 Kumimura S,Sohda T,Shijo H,et al.Hepatic fibrosis in rats fed a diet with ethanol and carbonyl iron.Int Hepatol Commu,1995,3(1):70.

　　6 范建高,曾明德,李继强,等.肝内脂肪和脂质过氧化与肝纤维化的实验研究.中华内科杂志,1997,36(12):808.

　　7 王泰龄,赵静波.酒精性肝病的病理.胃肠病学和肝病学杂志,1997,6(1):4.