乙型肝炎肝纤维化组织差异蛋白的筛选及DDAH1的功能研究

　　作者：罗新华，程明亮，张权，杨勤 作者单位：1.贵阳医学院附院 感染科， 贵州 贵阳 550004; 2.贵阳医学院 病理生理学教研室， 贵州 贵阳 550504

　　【摘要】目的： 对比分析乙型肝炎纤维化和非纤维化肝组织的蛋白质组表达谱的差异，探讨二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)在肝纤维化发生发展中的功能。方法： 利用双向凝胶电泳(2-DE)筛选肝纤维化和非纤维化肝组织差异表达的蛋白质，质谱鉴定差异蛋白质，Western-blot验证DDAH1的表达水平;测定肝组织中DDAH1活性，不对称二甲基精氨酸(ADMA)的含量，一氧化氮合酶(NOS)活性及NO2-/NO3-比值。结果： 鉴定出DDAH1等25个2倍以上的差异蛋白质;肝纤维化组织中DDAH1的活性降低， ADMA含量增加，NOS活性下降，一氧化氮(NO)含量减少。结论： 乙型肝炎肝纤维化与非纤维化肝组织的蛋白质表达谱有一定差异，DDAH1有可能通过调节ADMA的代谢而影响NO合成，参与了肝纤维化的发生发展。

　　【关键词】 肝炎，乙型，慢性; 纤维化; 蛋白质组学; 二甲基精氨酸; 二甲基氨基水解酶类

　　A Study on the Differential Proteins and Functions of DDAH1 in

　　Human Hepatitis B Derived Hepatic Fibrosis Tissues

　　LUO Xinhua, CHENG Mingliang, ZHANG Quan, YANG Qin

　　(1.Department of Infectious Disease, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang 550004, Guizhou, China;

　　2. Department of Pathophysiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To compare and analyze the difference of proteomic expression profiles between human hepatitis B (HB) derived hepatic fibrosis tissues and non-fibrosis liver tissues, and analyze the functions of dimethyl aminohydrolase(DDAH1)in the formation and development of hepatic fibrosis. Methods: The differential expression of proteins were screened with two dimension electrophoresis (2-DE) and identified with mass spectrogram after the total protein was extracted from hepatic fibrosis tissue and nonfibrosis liver tissue. DDAH1 expression was verified with Western-blot. DDAH1 activity,asymmetry diethylarginine,(ADMA)concentration,nitricoxide synthase(NOS) activity,and nitrogen monoxidium(NO)concentration were determined. Results: Twenty-five proteins with 2-fold difference were identified. The results of DDAH1 by western blot showed conformity with that by 2-DE. Further study showed that, in comparing with those of non-fibrosis liver tissue, the activity of DDAH1 was lowered with the increase of ADMA in hepatic fibrosis tissues (2.04±0.33 μmol/L vs 1.16±0.21 μmol/L, P<0.01), NOS activity lowered(4.39±0.66 U/ml vs 7.65±0.91 U/ml,P<0.05), and the NO content decreased(55.72±11.32 μmol/L vs 96.27±17.84 μmol/L,P<0.01). Conclusions: There is difference of protein expression spectra between HB derived hepatic fibrosis tissue and non-fibrosis liver tissue. DDAH1 might be involved in the formation and development of hepatic fibrosis by regulating ADMA metabolism and impacting NO synthesis.

　　[Key words] hepatitis B,chronic; fibrosis; proteomics; diethylarginine; dimethyl aminohydrolase

　　蛋白质组学作为后基因时代研究的一个重要内容，已广泛深入到生命科学和医药学的各个领域，将这种高通量的研究策略引入到肝纤维化发生过程的研究中，能够在一个实验系统中同时研究多种蛋白质的变化,有助于全面阐明肝纤维化的发生机制[1]。目前，有关肝纤维化发生机制的蛋白质组学研究基本集中在细胞培养及动物实验上，对人乙型肝炎肝纤维化的发生机制进行系统的蛋白质组学研究少见报道。2007年8月，以乙型肝炎肝纤维化患者为研究对象，对比研究其与人非纤维化肝组织蛋白组表达的差异，分析其中的部分差异蛋白在肝纤维化发生发展中的作用，以期揭示人类乙型肝炎肝纤维化发生的可能机制，为防治提供更为客观的科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 临床资料

　　6例肝纤维化组织来源于贵阳医学院附院及贵州省人民医院肝胆外科慢性乙型肝炎(CHB)患者因肝外伤、肝癌等进行肝脏手术时切除的肝脏标本，并根据2000年病毒性肝炎防治方案[2]中肝纤维化病理诊断标准诊断为肝纤维化3～4级。男5例，女1例，年龄38～56岁。6例非纤维化肝组织来源于同期肝血管瘤、肝外伤手术的肝脏标本，并经病理确诊，男4例，女2例，年龄31～52岁。所有样本均符合人体实验伦理学标准，并征得患者知情同意。取得组织后立即在无菌状态下用冰生理盐水洗净血液，-80 ℃冰箱中保存备用。

　　1.1.2 主要实验试剂

　　超纯尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟、二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂试剂盒、核酶混合物、碘乙酰胺、PVDF膜(美国GE公司)，固相pH梯度干胶条(美国Bio-Rad公司)，十二烷基硫酸钠、甲叉双丙烯酰胺、α氰基-4-羟基肉桂酸、乙腈(美国Sigma公司)，胰蛋白酶(美国Promega公司)，DDAH1 抗体(德国Merck公司)，一氧化氮试剂盒、一氧化氮合酶试剂盒(南京建成生物工程公司)。

　　1.1.3 主要实验仪器Ettan IPG phor Ⅱ等电聚焦系统、Ettan DALT 12垂直电泳系统、小型垂直电泳仪、Hoefer TE22电转仪、Imagescanner扫描仪、LabScan扫描软件(美国GE公司)，Autoflex MALDI-TOF质谱仪(德国Bruker公司)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，高效液相色谱(美国惠普公司)，国产721分光光度仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 双向凝胶电泳

　　参照文献[3,4，5]加以改进。分别称取100 mg纤维化和正常肝组织，匀浆后加10 μl核酶，裂解液400 μl充分混匀。离心取上清液进行Bradford法蛋白定量。选用pH3-10非线性(NL)的18 cm IPG干胶条，上样量1 000 μg进行再水化、等电聚焦，总电压为72 000 V/h。胶条平衡后，进行12%SDS-PAGE电泳。凝胶经考马斯亮蓝R250染色2 h，脱色2 h。透射扫描凝胶获取图像后,利用图像分析软件对图像蛋白质斑点自动检测，手工删除、添加斑点，匹配，筛选出在两种组织中差异表达的蛋白质。

　　1.2.2 MALDI-TOF-MS鉴定

　　切取差异蛋白质点, 再脱色、还原、烷基化、酶解、样品回收及脱盐处理。然后在MALDI-TOF质谱仪上分析。获得蛋白质点的肽质量指纹数据后，应用Mascot数据库进行查询。

　　1.2.3 Western-blot分析DDAH1的表达

　　提取肝组织蛋白质，取120 μg肝脏总蛋白于12%SDS-PAGE电泳3 h，转移至PVDF膜，5%脱脂奶封闭缓冲液中2 h。稀释DDAH1抗体(1:500)，孵育PVDF膜，4 ℃过夜。TBS-T洗膜4次，每次10 min。辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1:2500)孵育PVDF膜2 h，同前法洗膜4次，化学发光法显色，X线胶片曝光显影，凝胶成像系统摄像分析，用Bio-Rad的Quantity one对条带进行灰度分析，计量以平均光密度×面积来表示，然后分别与β-actin灰度值相比，作为DDAH1的相对含量。

　　1.2.4 DDAH1活性测定

　　不对称二甲基精氨酸(ADMA)被DDAH1水解后生成L-胍氨酸(L-cit)和二甲胺，可通过测定肝组织中L-cit的量来间接反映肝组织中DDAH1的活性。称取100 mg肝组织，加100 mol/L、pH6.5的磷酸盐缓冲液1 ml匀浆;离心后取160 μl上清液，加4 mol/L ADMA磷酸盐缓冲液240 μl，37 ℃孵育2 h;取200 μl孵育混合物，加8 mg磺基水杨酸，振荡混匀;离心取上清液，高效液相色谱法检测L-cit的含量，用线性梯度洗脱方式将样品从色谱柱洗脱。流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液(TFA), 流动相B为0.1%TFA和60%乙腈水溶液，流速为1.0 ml/min，检测波长为200 nm。

　　1.2.5 ADMA含量

　　取肝组织匀浆液250 μl，加1.2 mol/L过氯酸250 μl，离心10 min;再取200 μl上清液加0.5 mol/L磷酸二氢钠400 μl，100 μl内参溶液，400 μl ddH2O混合。高效液相色谱法检测ADMA含量，方法同前。

　　1.2.6 NO2-/NO3-及NOS活性测定

　　NO在组织中极不稳定，很快代谢为硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)，采用硝酸还原酶法，根据肝组织中NO2-/NO3-比值，推算出NO的浓度。NOS活性操作按试剂盒说明书进行。

　　1.3 统计学处理所有数据均以(x±s)表示，组间比较采用t检验。用SPSS11.0软件进行统计学处理，P<0.05 表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 差异蛋白质表达

　　对每一肝组织同时进行3次检测，分别获得3块平行胶。纤维化及非纤维化肝组织的平均蛋白质点数分别为(358±6)个和(389±9)个(图1)。利用图像分析软件对两组图谱进行差异分析，筛选出差异表达的蛋白点226个。其中2倍以上的差异点41个，包括在肝纤维化组织表达上调的蛋白点21个，表达下调的蛋白点20个。

　　2. 2 2倍以上差异蛋白点鉴定

　　对两种组织中表达量差异2倍以上的41个蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析，鉴定出25个与氧化应激、细胞信号转导、新陈代谢、细胞增殖等相关的蛋白质，其中12个蛋白质在肝纤维化组织中表达上调，13个在肝纤维化组织中表达下调。见表1。表1 人纤维化肝组织与非纤维化肝组织表达差异2倍以上蛋白点的质谱鉴定(略)

　　2.3 Western-blot验证

　　为了验证2-DE结果的可靠性，选择部分差异表达的蛋白质进行了Western-blot验证。结果显示，与非纤维化肝组织比较，纤维化肝组织中DDAH1的表达下降，与2-DE结果一致(图2)。

　　2.4 L-cit、ADMA的含量、NOS活性及NO2-/NO3-比值

　　见表2。表2 人纤维化和非纤维化肝组织中L-cit和ADMA含量、NOS活性和NO2-/NO3-比较(略)注：与非纤维化肝组织相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

　　3 讨 论

　　肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理基础，其发生、发展过程有多种细胞、细胞因子发生了一系列复杂的变化，多种蛋白质在此过程中亦发生了量的改变。通过2-DE比较乙型肝炎肝纤维化与非纤维化肝组织之间蛋白质组的异同,发现25个与氧化应激、细胞信号转导、新陈代谢、细胞增殖等相关的蛋白质在肝纤维化组织中表达发生了改变。但由于双向凝胶电泳和质谱鉴定实验流程长，环节及影响因素较多，对肝纤维化组织中出现表达变化的部分差异蛋白质进行了Western blot验证。结果表明，DDAH1的Western blot验证结果与2-DE的表达结果相符合。

　　DDAH的代谢底物ADMA作为某些疾病的一个新的高危因子，近年来已在心血管及肾脏疾病方面受到广泛关注，但在肝纤维化中的作用研究甚少。DDAH属于精氨酸修饰酶超家族，在肝脏、胰腺和肾脏等组织中普遍存在。DDAH存在由不同基因所编码的DDAH1和DDAH2两种亚型，它们在体内分布存在差异，DDAH1主要在肝脏和肾脏近端小管表达，而DDAH2在脉管系统中表达占优势[6]。两种亚型在体内均水解ADMA生成L-cit和二甲胺。用2-DE及Western blot的方法均发现DDAH1在肝纤维化组织中的表达较正常肝组织明显下降，进一步检测DDAH1的活性结果显示，在纤维化肝组织中DDAH1的活性也出现明显下降。Mookerjee等[7]发现，在人酒精性肝硬化组织中DDAH1的表达及活性下降，其代谢产物ADMA的含量增加，与本研究结果一致，提示DDAH1的表达变化可能参与了肝纤维化发生发展，但关于DDAH1在肝纤维化发病机制中的作用机制尚不清楚。

　　用高效液相色谱分析纤维化肝组织中DDAH1的作用底物ADMA含量，结果表明，纤维化肝组织中ADMA含量较正常肝组织明显增加，提示在肝纤维化发生时，由于DDAH1蛋白表达及活性的降低，对其底物ADMA的降解减少。因此，推测肝纤维化时，由于氧化应激增强，导致了DDAH1蛋白表达及活性降低，对ADMA分解减少，引起ADMA在肝组织中蓄积。肝组织中蓄积的ADMA抑制了肝组织中NOS 的活性，引起NO的合成减少。肝组织中NO减少，肝内血管阻力增加，引起肝组织缺血、缺氧，进一步引起肝实质损伤、HSC激活，促进肝纤维化的发生[8,9]。

　　由于NO的半衰期很短，NO生成后很快被氧化成NO2，进而迅速经自发的氧化而生成稳定的代谢产物NO2-/NO3-，故肝组织中的NO2-/NO3-间接反映NO的含量。为证实这个推测，对纤维化肝组织及非纤维化肝组织中NOS活性及NO的含量进行检测，结果显示，肝纤维化组织中NOS活性及NO2-/NO3-的含量均较正常肝组织明显减少，提示DDAH1通过调节ADMA，影响了肝组织中NO的代谢，这可能是DDAH1表达减少导致肝纤维化发生机制之一。

　　【参考文献】

　　[1]程明亮.细胞信号转导与功能蛋白质组学在肝纤维化发生机制研究中的新动向[J].中西医结合肝病杂志,2005(4):193-194.

　　[2]中华医学会肝脏病学分会传染病与寄生虫病学分会. 病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志,2000(6):1-8.

　　[3]Staudenmann W, Hatt PD, Hoving S, et al. Sample handling for proteome analysis[J]. Electrophoresi,1998(19):901-908.

　　[4]Nabetani T, Tabuse Y, Tsugita A, et al. Proteomic analysis of livers of patients with primary hepatolithiasis[J]. Proteomics,2005(5):1043-1061.

　　[5]Grg A, Obermaier C, Boguth G, et al. The current state of two dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J].Electrophoresis,2000(21):1037-1053.

　　[6]Palm F, Onozato ML, Luo Z, et al. Dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH): expression, regulation, and function in the cardiovascular and renal systems[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007(6):3227-3245.

　　[7]Mookerjee RP, Malaki M, Davies NA, et al. Increasing dimethylarginine levels are associated with adverse clinical outcome in severe alcoholic hepatitis[J]. Hepatology,2007(1):62-71.

　　[8]Langer DA, Das A, Semela D, et al. Nitric oxide promotes caspase-independent hepatic stellate cell apoptosis through the generation of reactive oxygen species[J].Hepatology, 2008(6):1983-1993.

　　[9]Leung TM, Tipoe GL, Liong EC, et al. Endothelial nitric oxide synthase is a critical factor in experimental liver fibrosis[J].Int J Exp Pathol,2008:241-250.