EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh-7细胞中的沉默效应
发表时间：2010-05-05 浏览次数：425次
作者：王怡，陈钢，陈必成，刘佳明，黄陈平 作者单位：1.温州医学院 环境与公共卫生学院，浙江 温州 325035;2.温州医学院附属第一医院 肝胆外科，浙江 温州 325027
【摘要】 目的 ：构建针对EphrinA1基因的发夹状RNA(ShRNA)表达载体pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA，观察其对人肝癌细胞Huh-7中EphrinA1基因表达的特异性抑制效应。方法 ：设计合成针对EphrinA1 mRNA的RNAi核苷酸片段，并定向克隆到pSilencer2.1-U6载体中，构建重组质粒pSilencer2.1-EphrinA1- SiRNA，同时构建不针对任何序列的重组质粒pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA，通过脂质体介导转染入Huh-7细胞，应用逆转录聚合酶链反应检测小干扰RNA的沉默效应。结果：酶切鉴定证实pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA和pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA重组质粒构建成功，转染Huh-7细胞后，pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA组EphrinA1 mRNA表达较pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA组和空白对照组明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA载体的成功构建为下一步研究以EphrinA1基因为靶位点的肝细胞癌基因治疗奠定了重要的实验基础。
【关键词】 EphrinA1;小干扰RNA;肝细胞癌
Construction of EphrinA1 SiRNA and analysis of its silenced effect in hepatoma cell line
Huh-7 WANG Yi， CHEN Gang， CHEN Bi-cheng， LIU Jia-ming， HUANG Chen-ping.
Environmental Science and Public Health School，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035
Abstract: Objective: To observe the inhibition effect of ShRNA on EphrinA1 expression in hepatoma cell line Huh-7 through construction of the expressed carrier pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA of EphrinAI. Methods: Two pairs of SiRNA were designed and synthesized according to the EphrinA1 mRNA sequence in GenBank，and then were inserted into pSilencer2.1-U6 plasmids to create recombinant plasmids pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA and pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA (control). After being transfected into Huh-7 cells，EphrinA1 expressed by ShRNAs was detected to be down regulated by RT-PCR. Results: All plasmids were constructed successfully. Expression of EphrinA1 in Huh-7 cells infected with pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA plasmids was significantly down regulated compared with that is infected with pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA plasmids (P<0.05). Conclusion: Con-struction of pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA lays an important experimental foundation for gene therapy of hepatocellular carcinoma (HCC) by targeting the EphrinA1 gene.
Key words: EphrinA1;SiRNA;HCC
受体酪氨酸激酶已经被公认为血管生成的重要信号分子，Ephrin配体及其受体Eph是其中最大的一个亚家族，其在肿瘤血管生成中的作用受到越来越多的关注[1]。近期有日本学者用cDNA微列阵分析显示EphrinA1在AFP相关的肝细胞癌中是最多过度表达的基因[2]。我们的前期研究也表明，在人肝癌组织切片中EphrinA1蛋白的表达明显增高并与其血管生成明显相关;EphrinA1的高表达与肿瘤的转移侵袭能力密切相关[3]。本实验拟构建靶向EphrinA1基因的RNA干扰重组体，通过沉默Huh-7肝癌细胞中EphrinA1基因的表达，以期为下一步探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用提供有力支持。
1 材料和方法
1.1 材料
Huh-7肝癌细胞株由湖南湘雅中心实验室提供;质粒pSilencer2.1-U6购自美国Ambion公司;T4连接酶及各种限制性核酸内切酶均购自美国Promega公司;脂质体Lipofectamine
2000购自美国Invitrogen公司;质粒提取试剂盒、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自TaKaRa公司;RT-PCR引物由上海生工合成。
1.2 EphrinA1-siRNA转录模板的发夹结构设计
将EphrinA1的mRNA全序列(GenBank NM_ 004428)输入到SiRNA Sepuence Selector中，筛选出一个19 nt的靶序列，阴性对照将SiRNA片段顺序打乱。SiRNA靶序列为5’-ACCACAGGCAT
AAGCTATC-3’，Scramble SiRNA靶序列为 5’-CA CACCATAATAAGGGTCC-3’。然后用SiRNA Hairpin Oligonucleotide Sequence Designer 软件设计成能与pSilencer2.1载体相连接的双链发夹结构。
序列结构为BamHI+sense+loop+antisense+终止信号+SalI+Hind III。
实验组DNA模板序列为：
5’-ACCACACCACAGGCATAAGCTATCTTCAAGAG AGATAGCTTATGCCTGTG GTTTTGCAATTCACAGCTT-3’
3’-TGGTGTGGTGTCCGTATTCGATAGAAGTTCT CTCTATCGAATACGGACACCAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’
阴性对照组DNA模板序列为：
5’-ACCACACCACGAGCATAAGCTATCTTCAAGAG AGATAGCTTATGCTCGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’
3’-TGGTGTGGTCTGCGTATTCGATAGAAGTTCTC TCTATCGAATACGGCCACAAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’
交由上海博亚公司合成。
1.3 插入片段的退火和连接
将合成的寡核苷酸链溶解在ddH2O中，各取1μL正义和反义寡核苷酸链溶液，再加入48μL退火缓冲液，充分混匀，配制成50μL溶液，在PCR仪上95 ℃孵育4 min，70 ℃孵育10 min，缓慢冷却至4 ℃;以Hind III，BamH I双酶切pSilencer2.1-U6质粒，使载体线性化，取退火后的插入片段溶液1μL+线性化pSilencer2.1-U6质粒5μL+T4连接酶2μL+T4连接酶缓冲液2μL在4 ℃下过夜。分别命名为pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA和pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA。
1.4 重组质粒转化宿主菌以及质粒的提取和鉴定
以常规方法制备并转染感受态宿主菌DH5α，质粒的提取则按产品说明书进行，最后提取的质粒DNA，经Sal I和EcoR I双酶切鉴定。
1.5 质粒转染
采用Lipofectamine2000脂质体介导的转染法。在转染前一天，换液后调整Huh-7细胞密度为2×105/mL，以每孔2 mL接种于6孔板，待细胞增至80%融合时，将质粒、脂质体按体积比1:6混合后转染至细胞中，操作按照说明书进行。
1.6 细胞内总RNA的提取及RT-PCR
采用Trizol一步法提取总RNA;逆转录得到cDNA后行PCR反应;EphrinA1：正义5’-AACAAGCTGTGCAGGCATGG-3’，反义5’-CTCCACAGATGAGGTCTTG C-3’，产物230 bp;GAPDH引物(产物315 bp)：正义5’-GTCAACGGATTTGG TCTGTATT-3’，反义5’- AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’; 扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，28个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃降温。结果观察PCR产物经2%琼脂凝胶电泳，EB染色检测，用凝胶成像分析系统(英国UVP公司GDS8000)对DNA条带扫描，并分析结果。
1.7 统计学处理方法
采用方差分析。
2 结果
2.1 pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA和pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA质粒酶切鉴定
根据pSilencer2.1U6载体的限制性内切酶图谱，质粒载体中无Sal I的酶切位点，而在我们的插入序列里面加入了Sal I的酶切位点，其酶切点在793 bp位置，质粒本身在397 bp处有单一的EcoR I位点，双链寡核苷酸片段则插在BamH I和Hind III中间，因此pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA和pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA重组质粒均可用EcoR I和Sal I双酶切进行鉴定。两重组质粒双酶切后均可切出大小为456 bp的DNA片段，电泳结果与预期结果一致(见图1)。
2.2 重组质粒的沉默效应
RT-PCR结果显示：转染48 h后pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA组的EphrinA1 mRNA表达水平较pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA组和空白对照组明显下调，三者的灰度比值分别为0.18±0.15、0.61±0.18和0.74±0.21，前者的灰度比值与后二者相比均明显降低，其差异均有显著性(P<0.05)，而后二者灰度比值差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
RNA干扰现象(RNA interference，RNAi)，是由双链RNA介导的，在转录后水平关闭相应的基因序列表达的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默。它由Fire于1998年在秀丽隐杆线虫的研究中首先发现并报道[4]。用RNAi技术可以高效、特异、快速地抑制细胞内癌基因的表达，使癌症表型逆转或病程得以控制。和其他基因干预技术相比，RNAi具有两个明显的特征：抑制基因表达的高效性和高度的基因序列特异性——这为我们进行人肿瘤细胞的RNAi抑制特异基因表达的研究提供了理论基础[5]。
血管生成是实体瘤生长的基础，又是转移的重要途径。肝细胞癌为典型的多血管型肿瘤，故抗血管生成治疗具有重要意义。Eph/Ephrin是新近发现的受体酪氨酸激酶家族成员，其在肿瘤血管生成中的作用已经受到广泛的关注。研究证实EphrinA1可通过与其受体结合，激活下游的信号传导通路，从而调控内皮细胞的激活、黏附、转移以及渗透，最终影响如乳腺癌[6]、结肠癌[7]、胃癌[8]、卵巢癌[9]等多种肿瘤的血管生成。同时针对Eph/Ephrin系统的抗肿瘤及抗血管生成基因治疗均显示出巨大的潜力[10]。我们的前期研究表明在人肝癌组织切片中EphrinA1的表达明显增高并与其血管生成明显相关;EphrinA1的高表达与肿瘤的转移侵袭能力密切相关[3]。
在本实验中我们成功地构建了针对EphrinA1基因的RNAi序列，并克隆至载体pSilencer2.1-U6中，下一步我们将进一步检测EphrinA1基因沉默后对人肝癌细胞Huh-7生物学行为的影响，以探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用，以期能为临床上肝细胞癌的治疗提供新的靶点。
【参考文献】
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