组织因子表达与肝癌微血管生成关系及临床意义

作者：丁会民，秦锡虎，朱峰，谈炎，金雷    作者单位：（苏州大学第三临床医学院，江苏 常州 213003，1.肝胆外科；2.病理科） 　　【摘要】  目的 探讨组织因子（tissue factor，TF)在人肝细胞肝癌组织中的表达与肿瘤组织微血管形成过程之间的关系和临床意义。方法 对54例人肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC)及相应的癌旁肝组织标本，进行了TF和CD34免疫组织化学EnVisionTM法检测。结果 ?譹?訛肝癌组织中TF阳性表达率为63．00％(34/54)，MVD值为53.17±27.04；癌旁肝组织中TF阳性表达率为5.60％(3／54)，MVD值为19.15±6.92。肝癌组织中TF的表达和MVD值之间存在正相关性(r=0.662，P<0.01)；?譺?訛肝癌组织中TF的表达与患者Edmondson-steinerⅢ+Ⅳ、静脉浸润、肝内外转移、无或包膜不完整、甲胎蛋白（AFP）≤20 ng/ml有关（P<0.05)；多因素Logistic回归分析表明：TF表达是肝癌静脉浸润的独立危险因素之一。结论 肝癌组织中异常表达增高的TF与肝癌微血管形成过程及部分侵袭转移指标相关，提示TF可能促进了肝癌的发生与侵袭转移。 　　【关键词】  肝肿瘤；组织因子；抗原，CD34；微血管密度；免疫组织化学　　Relationship between tissue factor expression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma and its  clinical significance     DIN Huimin， QIN Xihu， ZHU Feng， et al.  Department of Hepatobiliary Surgery， the Third Affiliated Hospital of Suzhou University， Changzhou 213003　　Abstract   Objective  To investigate the relationship between tissue factor (TF) expression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma(HCC) and its clinical significance. Methods  The expression of TF in 54 specimens of HCC and in their adjacent liver tissue was detected with EnVisionTM immunohistochemistry． Tumor microvessel density (MVD) was evaluated using CD34 antibody as an endotheliaI marker with the same technique as well． Results  (1)Positive rates of TF and the mean value of MVD were significantly higher in HCC than those in the adjacent liver tissue (63．00％ vs 5.6％ and 53.17±27.04 vs 19.15±6.92， P<0．01)． TF expression was positively correlated with MVD value (r=0.662， P<0.01). (2)TF expression was correlated wtih vein invasion， intrahepatic metastasis， no envelope， AFP≤20 ng/ml and Edmonson stage Ⅲ+Ⅳ (P<0．05)． Multivariate Logistic regression analysis showed that TF expression was one of the independent risk factor in venous invasion of the liver cancer. Conclusion  Overexpression of TF has a relationship with angiogenesis， metastasis and invasion of hepatocellular carcinoma．　　Key words   liver neoplasms； tissue factor； antigens， CD34； microvessel density； immunohistochemistry　　组织因子（tissue factor，TF，凝血因子Ⅲ）为外凝血途径的启动因子。近年来发现TF还涉及血管形成、胚胎发育、细胞黏附与运动、细胞内信号传导和恶性肿瘤侵袭与转移等生物学过程，但其中机制尚不十分清楚。本实验采取免疫组织化学EnvisionTM法测定肝癌组织TF及CD34（反映微血管增生的主要指标之一），对TF表达与肝细胞癌微血管增生之间的关系及临床意义进行探讨，旨在为临床治疗肝癌提供依据。　　1  资料和方法　　1.1  研究对象  收集苏州大学附属第三医院肝胆外科2004年5月至2007年4月间，病理确诊的原发性肝细胞肝癌手术切除存档蜡块标本54例及相应癌旁组织标本（距离癌灶边缘1～2 cm，病理证实为非肿瘤组织）。其中男性38例，女性16例；年龄40～80岁，中位年龄（53.85±12.07）岁；血清乙肝表面抗原（HBsAg）阳性42例，阴性12例；患者病理资料：肿瘤直径（d）≤5 cm 15例，＞5 cm 39例；按照Edmondson-steiner标准，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级分别有10，20，18，6例；Child-pugh分级A，B级分别有40和14例；经病理证实肿瘤包膜基本完整28例，无包膜、包膜侵袭破坏者26例；肿瘤肝内播散或有卫星灶10例；肝门淋巴结转移者2例；肝外转移者1例；静脉癌栓者20例。所有患者均未行术前放化疗、肝动脉栓塞及免疫治疗。　　1.2  方法   　　1.2.1  免疫组织化学染色  兔抗人TF免疫组化单克隆抗体（浓缩型）（Rabbit Anti-Human TF Monoclonal Antibody)购于武汉博士德生物技术开发公司，配制成工作液浓度为1∶100。鼠抗人CD34免疫组化单克隆抗体(即用型）（Mouse Anti-Human CD34 Monoclonal Antibody)和EnvisionTMplus试剂盒购于福建迈新生物技术开发公司，其余实验材料及试剂均取自苏州大学附属三院病理科。实验时制备3 ?滋m连续切片，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，高温高压抗原修复，EnvisionTM法染色，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。每批染色均用已知阳性片作阳性对照，PBS分别代替TF、CD34单克隆抗体作为阴性对照。　　1.2.2  结果判断  参照文献[1-2]，TF染色强度分（-）～(+++)四级，染色强度（++）～(+++)判断为阳性，染色强度（-）～(+)判断为阴性。标准判定：TF染色阴性（－）：染色细胞数﹤10%，不论染色强弱；TF染色强度弱阳性（＋）：染色细胞数﹤50%，不论染色强弱；TF染色强度阳性（++）：染色细胞数﹥50%，但染色较淡；TF染色强度强阳性（+++）：着色细胞数﹥50%，但染色较强。2名病理医生采用双盲法分别对同一切片强度评定。CD34阳性标准按Weidner等［3］方法。MVD计数：肝窦内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞族代表1条单独的微血管。如果主要结构不相连，分支结构也作为一个血管计算，凡管腔大于8个红细胞直径或肌层较厚者不列入计数；按照Weidner等方法并加以改进，先在低倍视野内(×40、×100)找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域，然后在高倍视野内(×400)分别选择5个最高血管密度区域计数微血管的数目，求其平均值作为该患者的MVD值。分辨不清或染色模糊的细胞不计入计数结果。2名病理医生采用双盲法分别对同一切片计数，取两者计数中较高的数据作为该切片的MVD。　　1.3  统计学方法  SPSS10.0软件包处理数据。计量资料经过正态检验和方差齐性检验，数据用x±s表示，采用t检验（Independent-Samples T Test）或one-way ANOVA检验；计数资料采用?字2（Pearson Chi-Square Test）或Fish确切概率法；两组变量间的相关分析采用Bivariate过程；多因素Logistic法用于肝癌静脉浸润危险因素的筛选。双侧可信区间P<0.05定为具有统计学意义。　　2  结果　　2.1  TF表达结果  癌旁肝组织TF阳性率5.6％ (3／54)。TF呈棕黄色染色主要位于细胞浆，阳性细胞为靠近血管外膜的少量腺体细胞和巨噬细胞。肝癌组织中TF阳性率63％(34／54)，TF呈棕黄色染色主要位于细胞浆，阳性细胞为部分癌细胞、少量巨噬细胞和血管内皮细胞(见图1～2)。肝癌组织TF阳性率明显高于正常肝组织，差异具有显著统计学意义(?字2=39.508，P<0.001)　　2.2  CD34及MVD计数结果  CD34呈棕黄色染色定位于血管内皮细胞膜上。在肝癌组织内显示弥漫的强阳性表达，显示的微血管在分布上有明显异质性，高密度染色区域主要位于癌灶边缘，而癌中心区染色密度较低（见图3～4）；而癌旁肝组织多为阴性，阳性主要见于汇管区及纤维间隔内的血管壁，在纤维间隔向肝实质内伸展区周围肝组织内可见少量散在的CD34弱阳性表达。肝硬化组织中除汇管区和纤维间隔中有CD34阳性的小血管外，伴有明显炎细胞浸润的纤维间隔周边的肝窦内可见少量散在的CD34淡黄色阳性表达。癌旁肝组织MVD值为19.15±6.92，肝癌组织MVD值53.17±27.04，肝癌组与癌旁组MVD值差异有统计学意义（t=-12.038，P<0.001)。　　2.3  肝癌组织中TF与CD34的关系  TF阳性组（63%）MVD值为56.15±13.82，TF阴性组（37%）MVD值为33.70±12.46，两组间差异具有统计学意义（F=2.508，P=0.018)。肝癌组织中TF阳性率与MVD值呈正相关（r=0.662，P﹤0.01)，组织中TF表达越高，相应MVD值亦越大。　　2.4  TF表达与临床病理特征的关系　　2.4.1  单因素分析  结果表明，肝癌组织中TF的表达与患者年龄、性别、HbsAg、肿瘤大小、肝硬化与否无关（P>0.05)；在Edmondson-steiner Ⅲ+Ⅳ、有静脉浸润、无包膜、AFP≤20 ng/ml、有肝内外转移组织中TF阳性率明显增高(P<0.05)（见表1)。　　2.4.2  多因素Logistic回归分析  以肝癌静脉浸润作为因变量，以年龄、性别、HbsAg、肿瘤直径、肝内外转移、包膜、AFP、肝硬化及TF 9种因素作为自变量行单因素分析，取统计学P<0.05的7种变量行Logistic回归分析。结果表明，肝癌组织中的TF表达是影响肝癌静脉浸润的独立危险因素之一[Exp(B)=8.671E-02，P=0.023]，其他独立危险因素为肿瘤直径[Exp(B)=18.967，P=0.004]、肝内外转移[Exp(B)=11.384，P=0.049]以及AFP[Exp(B)=0.140，P=0.046]（见表2）。　　3  讨论　　体内恶性肿瘤的生长不仅取决于肿瘤细胞的种植效率和增生速度，还取决于肿瘤新生血管的形成。血管形成一部分源于原血管网的过度生长，另一部分源于血管内皮族细胞形成的新生血管[4]，而且血管生成前肿瘤细胞几乎不能进入血液循环，但血管生成后进入血液循环的肿瘤细胞与血管密度成正比。MVD通常被用来判断肿瘤微血管的增殖状况，CD34是形成血管的再生上皮细胞的一个标志物，标志的微血管是毛细血管，而在正常肝组织窦状表面不标志，其敏感性和特异性均优于Ⅷ因子、CD31、vWF、UEA-1，是目前测定MVD的良好指标[5]。本实验结果显示，肝癌组与癌旁组MVD值比较差异有统计学意义(P<0．01)，说明肝癌组织中微血管增殖活跃。　　Abe等[6]分别将高表达TF和VEGF的黑色素瘤细胞株与低表达TF和VEGF的黑色素瘤细胞株接种到严重联合免疫缺陷小鼠皮下，结果发现，注射高表达TF和VEGF的细胞株后8～10周内小鼠体内出现了高度血管化的肿瘤，而注射低表达TF和VEGF细胞株的小鼠体内形成血管化程度很低的肿瘤，过度表达TF的肿瘤细胞生长更迅速，肿瘤组织内形成的血管较粗且丰富。因此，认为TF与肿瘤血管生成密切相关，可能是肿瘤血管生成的标志物。Zhang等[7]发现转染有全长TFcDNA的小鼠肉瘤细胞接种后形成体积更大、生长更快、血管密度更高的肿瘤。本研究结果显示，TF阳性率肝癌组织与正常组比较，两组差异有统计学意义(P<0．01)，说明肝癌组织中TF存在过度表达，可能参与肝癌的进展；随着肿瘤中TF(-)～(+++)逐步递增，相应MVD值也呈阶梯式增高，这提示肝癌组织中TF的表达与微血管的形成呈正相关，可能促进肿瘤微血管的生成。近年来发现TF在多种恶性肿瘤中过度表达，可作为判断患者预后的参考标志。周奇等[8]测定50例肝癌血浆及27例肝癌组织标本TF mRNA后发现，肿瘤直径>5 cm、肝内外转移、门静脉浸润、Edmondson-steiner Ⅲ＋Ⅳ中TF明显增高(P<0.05)，TF是影响HCC预后的独立危险因素。然而Rullier等[9]采用免疫组织化学方法在19例正常肝组织、33例肝硬化患者组织及30例肝癌患者组织中检测TF发现，TF在正常及肝硬化组织表达大于90％，而在肝癌组织中表达仅为50％。本实验发现，HCC组织中TF阳性率63.0%，显著高于癌旁组织（P<0.001)；在影响肝癌预后的典型不良因素（如肝内外转移、静脉浸润、无包膜、Edmondson-steiner Ⅲ＋Ⅳ）中TF明显增高（P<0.05)；对肝癌预后有重要影响的因素肝静脉浸润行Logistic回归分析表明，TF是影响肝静脉浸润的独立危险因素之一。这提示TF阳性的患者多属于中晚期者，支持TF与肝癌侵袭转移有关，可作为判断患者预后的参考标志之一。结合本实验已证实的肝癌组织中TF与肿瘤微血管生成呈正相关的结果，我们认为：肝癌细胞可诱导TF异常表达，表达的TF可能作为血管生长因子之一参与肿瘤微血管生成，增生的血管为肿瘤细胞提供养分及通路，从而使肿瘤细胞得以持续增殖、迁移、黏附。　　Ishibashi等[10]报道转移性黑色素瘤细胞表面的TF表达比非转移性黑色素瘤细胞高1 000倍，而使用抗体阻断TF的受体功能后，可使裸鼠肺部血管的肿瘤细胞数减少、肺转移灶减少。这不但验证本实验的观点，而且还为临床进行肿瘤的抗血管生成治疗提供了可能。　　综上所述，可认为，肝癌组织TF的表达与其微血管的异常增生呈正相关。我们发现TF阳性表达的患者进展快，发现时多属中晚期，预后差。肝癌组织中TF的表达状况有可能作为判断肝癌微血管增生状况和患者预后的参考指标之一。但有关TF与肝癌微血管形成关系的分子机制仍需进一步研究。　　【参考文献】　　[1] Wan YL， Yao HW， Ye JM， et a1． The role of tissue factor expression in the invasive and metastatic ability of colorectal carcinoma[J]． Zhonghua Waike Zazhi，2004，42(3)：149-153．　　[2] Poon RT， Lau CP， Ho JW， et a1． Tissue factor 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