乌司他丁、地塞米松对急性坏死性胰腺炎大鼠TNF-α、IL-10和GR的影响

乌司他丁、地塞米松对急性坏死性胰腺炎大鼠TNF-α、IL-10和GR的影响作者：刘纳新，刘存丽，施红旗，陈周浔，周蒙滔，朱耶凡，余震    作者单位：（温州医学院第一附属医院，浙江 温州 325000，1.普外科；2.检验科）    【摘要】  目的 探讨急性坏死性胰腺炎大鼠（acute necrotizing pancreatitis，ANP）TNF-α、IL-10和糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）的变化规律及乌司他丁（ULI）、地塞米松（DEX）干预对上述指标的影响。方法 80只SD雄性大鼠随机分为5组：①假手术组（S组，n＝16）；②急性胰腺炎组（A组，n＝16）；③ULI组(U组，n＝16)；④DEX组（D组，n＝16）；⑤ULI+DEX组（UD组，n＝16）。除S组外，其余各组均通过逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠制作ANP模型。分别在模型制作成功后8 h和12 h，观察大鼠胰腺病理改变判断ANP严重程度；酶法检测血清淀粉酶（amylase，AMY）水平，ELISA检测血清TNF-α、IL-10蛋白水平以及RT-PCR检测全血有核细胞GR的mRNA表达。结果 ①A组大鼠表现为典型ANP病理改变，包括间质水肿、炎细胞浸润、出血和胰腺坏死。ULI和DEX单用或两药联用均可减轻ANP的炎症反应，两者联合应用可能存在协同效应。②A组血清TNF-α、IL-10显著高于S组(P<0.01)，ULI和DEX无论是单独应用还是联合应用均可使TNF-α下降以及IL-10上升。③在术后8 h和12 h，U组、D组GR mRNA表达显著低于S组（分别为P<0.05和P<0.01）；术后12 h UD组GR mRNA组显著高于A组(P<0.05)。结论 TNF-α、IL-10 以及GR的改变与ANP的炎症反应存在相关性，而ULI和DEX可能通过影响这些因素达到缓解ANP的作用；两药联合应用可能存在协同作用。    【关键词】  乌司他丁；地塞米松；急性坏死性胰腺炎；肿瘤坏死因子α；白细胞介素10；糖皮质激素受体；大鼠    Influence of Ulinnastatin and Dexamehasone on blood TNF-α， IL-10 and GR in rats with acute necrotizing pancreatitis      LIU Naxin*， LIU Cunli， SHI Hongqi*， et al. * Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000    Abstract   Objective  To investigate the changes of TNF-α， IL-10， glucocorticoid receptor  (GR) in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and the influence of Ulinnastatin and Dexamehasone on these para-meters in ANP rats. Methods  Eighty male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into five groups： ①sham-operation group （group S， n＝16）； ②acute-necrotizing-pancreatitis group (group A， n＝16)； ③ULI-treated group (group U， n＝16)； ④DEX-treated group (group D， n＝16)， ⑤ULI-and-DEX-treated group (group UD， n＝16). ANP model was induced by intergraded injection of 5% sodium taurocholate to biliopancreatic duct in the rats except for group S. After the experiment model was established for 8 h and 12 h， the severity of ANP pathology was confirmed with histological morphology； the serum AMY level was measured with enzymatic method； the serum TNF-α， IL-10 levels were detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)； and the mRNA expression of GR in blood was measured with semiquantitative RT-PCR. Results  ①Typical ANP pathological changes were found in group A， including interstitial edema， infiltration of inflammatory cells， hemorrhage and parenchyma necrosis. The inflammation was relieved in ANP rats treated with Ulinnastatin， Dexamehasone or the combination of both drugs； the synergistic effect was found in group UD. ②The concentration of serum TNF-α， IL-10 in group A were increased obviously than that in group S (P<0.01). The concentration of serum TNF-α decreasing and IL-10 increasing in rats were induced by the single or combination usage of Ulinnastatin and Dexamehasone (P<0.01 or P<0.05). ③The mRNA expression of blood GR in group U and group D was lower significantly than that in group S 8 h or 12 h after the operation (P<0.01 or P<0.05)； furthermore， the GR expression level in group UD 12 h after the operation was higher than that of group A (P<0.05). Conclusion  The changes of TNF-α， IL-10， GR are involved in the inflammation response of rat ANP， Ulinnastatin or Dexamehasone can relieve ANP inflammation response by affecting these factors， and the combination of both drugs has a synergistic effect.    Key words   Ulinnastatin； Dexamethasone； acute necrotizing pancreatitis； tumor necrosis factor-alpha；    interleukin-10； glucocorticoid receptor    乌司他丁（Ulinastatin，ULI）是一种广谱的蛋白酶抑制剂，可通过抑制多种蛋白酶从而达到抑制炎症过程，有报道提示应用ULI治疗急性胰腺炎可取得较好的临床结果[1]。地塞米松(Dexamethasone，DEX)作为临床上常用的糖皮质激素（glucocorticoid， GC），对各种原因（物理、化学、生物、免疫等）引起的炎症都有很强的消炎作用，但对GC在急性胰腺炎中的应用一直存在争议。近年来随着对脓毒血症中GC作用机制的研究不断深入，应用GC治疗急性胰腺炎的报道逐渐增多。本实验通过逆行注射5%牛磺胆酸钠建立急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）模型，继而应用ULI和DEX对其进行早期干预，观察ULI和DEX对大鼠胰腺病理学，血AMY、TNF-α、IL-10和全血有核细胞GR mRNA表达的影响。1  材料和方法    1．1  动物分组  清洁级SD雄性大鼠80只，质量270~350 g，普通大鼠饲料喂养2周。术前12 h禁食不禁水，随机分为5组，每组各16只：①假手术组（S组）；②胰腺炎组（A组）；③ULI治疗组(U组)；④DEX治疗组(D组)；⑤ULI+DEX治疗组(UD组)。    1．2  动物模型制备及处置  A组：0.5%戊巴比妥钠（剂量40 mg/kg）腹部皮下注射麻醉。麻醉成功后，正中切口切开大鼠腹部，在胆胰管与十二指肠交汇附近，用锐性5号针头透过十二指肠肠壁将胰胆管刺一小口，有胆汁溢出后，换用另一钝头5号针头逆行穿入胰胆管。用1 ml注射器向胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠（用药剂量1 ml/kg，注射速度0.2 ml/min），注药期间分别阻断胆胰管上下端，以防牛磺胆酸钠注入肝脏和逆流入十二指肠，注药后继续阻断胆胰管上下端5 min，可观察到胰腺肿胀及点状出血，说明动物模型已建立，移去夹在胰腺管的小动脉夹，两层关腹，术后禁食而不禁水。U组：在ANP制模关腹后肌注ULI 2 000 U/100 g。D组：在ANP制模关腹后肌注DEX 0.2 mg/100 g。DU组：在ANP制模关腹后分别肌注ULI 2 000 U/100 g及DEX 0.2 mg/100 g。S组：腹部手术仅开腹后翻动胰腺后关腹，其余步骤同A组。    1．3  标本的采集制备  各组分别在制模后8 h和12 h处死其中8只大鼠。仍麻醉后开腹，取腹腔静脉血5 ml，其中0.5 ml应用2％ EDTA-Na2抗凝，待作RT-PCR检测；剩余血标本离心后取血清保存于 -20℃冰箱，待测血淀粉酶、TNF-α和IL-10。取胰头部组织1块，用10％中性福尔马林固定待作病理学检查。    1．4  指标检测    1．4．1  胰腺的病理组织学观察  观察胰腺的大体改变，取相同部位石蜡包埋，连续切片，苏木素-伊红染色，观察光镜下病理变化。    1．4.2  血清AMY、TNF-α及IL-10检测 标本置7600-110自动分析仪按α-淀粉酶试剂盒步骤检测血清AMY；按照试剂盒步骤采用ELISA法检测TNF-α和IL-10。    1．4．3  全血有核细胞GR的mRNA表达检测（RT-PCR法）  先用红细胞裂解液提取全血有核细胞，再用Trizol试剂提取全血有核细胞总RNA，以β-actin为内参。引物由上海生物工程技术有限公司合成。序列如下：GR扩增引物：上游：5′- TGCTCTGCTTTGCTCCTGAT-3′，下游：5′-TCCCTTCCCTTTTGACGATG-3′；β-actin扩增引物：上游：5′-GCCCATCTATGAGGGTTAC-3′，下游：5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′；PCR条件为：①94℃预变性5 min；②94℃ 50 s、58℃ 50 s、72℃ 45 s，33个循环；③72℃ 10 min；④4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色。RT-PCR扩增GR、β-actin的片段长度分别为261 bp和571 bp。凝胶成像系统摄像并分析结果。    1．5  统计学方法  统计分析采用SPSS 12.0软件。数据以均数±标准差（x±s）表示。多组样本均数比较采用方差分析（One-way ANOVA），方差齐者采用Bonferroni检验，不齐者采用Tamhane’s T2检验。2  结果    2．1  一般状况及胰腺病理形态改变  动物麻醉清醒后对外界刺激反应灵敏度和摄水行为的观察：S组大鼠在不同时间段对外界反应灵敏，能自主摄水。A组、U组、D组和UD组随时间的推移，对外界反应灵敏度降低，其中A组最迟钝，以UD组最佳。A组初期大量摄水，随时间推移减少；U组、D组和UD组在观察期间具有较平稳的摄水行为。　  胰腺病理形态改变：S组，腺叶、腺泡完整，腺泡间隙致密，未见出血及坏死，偶有少量炎细胞浸润（见图1A）。A组，术后8 h，腺泡细胞水肿，部分腺导管扩张，胰腺间质增宽，腺泡间隙内可见出血现象，大量炎细胞浸润，可发现片状坏死（见图1B）。术后12 h，腺泡结构破坏，腺叶内可见大片无结构坏死区，坏死面积增大；腺叶间隙增宽，中等量炎症细胞浸润，较少出血（见图1C）。U组、D组和UD组： 8 h，各组与A组比较坏死区相差不大，腺叶内和间隙内炎症细胞浸润明显减少，未见出血现象（见图1D）；12 h组，U组、D组和UD组之间比较及与A组比较坏死程度相差不大，腺叶内均可见片状坏死区，腺叶间隙增宽，有炎症细胞浸润（见图1E）。    2．2  全血有核细胞GR mRNA变化和血清AMY、TNF-α、IL-10浓度的变化  见表1。术后8 h和12 h各实验组（U组、D组、UD组和A组）大鼠的血清AMY均高于S组(P<0.01)，U组和UD组术后8 h血清淀粉酶显著低于A组(P<0.01)。术后8 h，各实验组大鼠的血清TNF-α均高于S组(P<0.01)，U组和UD组血清TNF-α显著低于A组(P<0.01)；术后12 h，A组、U组和D组血清TNF-α高于S组(P<0.01)；U组、D组和UD组显著低于A组(P<0.01)。术后8 h和12 h各实验组大鼠血清IL-10均显著高于S组(P<0.01)；U组、D组、UD组血清IL-10术后8 h和12 h均高于A组(分别为P<0.05和P<0.01)。在术后8 h，各实验组GR mRNA表达均低于S组，其中U组、D组有统计学意义(P<0.01)，U组、D组显著低于A组（P<0.01）；在术后12 h，A组、U组和D组显著低于S组（分别为P<0.05和P<0.01），UD组显著高于A组(P<0.05)。3  讨论    3．1  ULI和DEX对胰腺炎症和淀粉酶的影响  ULI是一种广谱的蛋白酶抑制剂，近年广泛应用于急性胰腺炎治疗并已取得良好效果[1]。DEX作为临床上常用的肾上腺皮质激素（GC），对各种原因（物理、化学、生物、免疫等）引起的炎症都有很强的消炎作用。本实验发现，ULI和DEX对急性坏死性胰腺炎干预后，两种药物对胰腺坏死程度影响不大，但无论是单独应用还是联合应用均可明显减少胰腺组织的出血和炎症细胞浸润；急性坏死性胰腺炎可出现血清淀粉酶显著升高(P<0.01)，ULI和DEX干预可使血清淀粉酶下降，两者联用下降幅度尤为明显，其中8 h UD组显著低于同时间段A组(P<0.01)。以上结果说明，ULI和DEX对ANP的局部炎症和全身炎症反应均可产生影响，而两者联合应用可能存在协同效应。    3．2  ULI和DEX对ANP大鼠细胞因子的影响  　　TNF-α、IL-10分别是体内最重要的促炎和抗炎细胞因子，急性炎症发生时两者可同时升高，机体始终处于抗炎和抑炎的平衡状态之中[2]。TNF-α是由激活的巨噬细胞、淋巴细胞分泌的细胞因子。TNF-α早期升高后，可诱导IL-6、IL-8及其自身的基因表达引起级联反应造成炎症介质的失控性释放，由于机体存在自我清除机制，TNF-α随着时间推移可自行下降[3]。IL-10主要由Th2细胞产生，具有潜在的抗炎功能，随着炎症反应加重逐步升高[4]。本实验发现，A组在8 h和12 h时TNF-α、IL-10均高于S组(P<0.01)，但升幅均不高。本研究发现TNF-α升高幅度不大，推测可能与机体已经开始自我清除有关，而IL-10升高幅度不大提示其正处于上升期的初期。    ULI是一种酸性糖蛋白，具有很广的抑酶谱和抑酶活性，它能通过抑制弹性蛋白酶等多种蛋白酶减轻组织的损伤，减少组织细胞破坏产生的炎症刺激物对巨噬细胞的进一步激活，打断炎症激活的恶性循环[1]。GC是机体内重要的内源性抗炎物质，在防止应激性损伤的发生中发挥重要作用[5]。本实验发现U组、D组、UD组不同时间段血清TNF-α均低于A组；除U组8 h外，其余各组TNF-α浓度下降均有统计学意义(P<0.01)，其中UD组12 h下降幅度最大。同时本实验还发现U组、D组、UD组不同时间段的IL-10均显著高于A组(分别为P<0.05和P<0.01)。施旖旎等的实验[6]提示，SIRS患者在应用ULI时具有降低TNF-α和升高IL-10的作用。Azab等[7]发现DEX可以减低心脏旁路手术时血中TNF-α/IL-10的比值。本实验结果与上述文献报道相一致。    3．3  ULI和DEX对ANP大鼠GR mRNA表达的影响  急性胰腺炎时引发的SIRS可对机体造成强烈应激，继而应激激素如GC大量释放。GC是机体内重要的内源性抗炎物质，在应激时与GR结合后发挥其病理生理效应；但由于同时存在的“糖皮质激素抵抗”现象，这种作用被削弱。有研究提示应激时外周血单个核细胞中GR位点表达减少可能与“糖皮质激素抵抗”有关[8]。本实验发现急性胰腺炎血的GR显著下降，随着时间推延下降幅度增大，其中12 h组显著低于S组。吴永恒等[9]发现强烈的应激可使机体GC大量释放而GR显著下降，这种矛盾现象直接影响GC在应激时的内源性抗炎作用。文献中应用GC治疗急性胰腺炎得出的矛盾结论可能与此有关，当急性胰腺炎早期GC有足够的GR与其结合，从而使其抗炎作用得以发挥，而随着急性胰腺炎的加重，残存的GR数量不足，GC的作用也被削弱。在我们实验中，在术后8 h和术后12 h，A组、U组、D组、UD组GR mRNA表达均低于S组，其中U组、D组下降幅度尤为明显（分别为P<0.05和P<0.01）；UD组GR mRNA表达维持在较高水平，其中12 h组显著高于A组(P<0.05)。以上结果说明，无论ULI还是DEX在发挥其抗炎作用时，均可能耗竭更多的GR受体才能发挥其作用；而联合应用时，两者之间可能存在某种未知因素使得GR受体消耗降低，其确切作用机制尚需进一步的深入研究。【参考文献】[1] 曾文红，白国强. 乌司他丁研究进展[J]. 中华肝胆外科杂志，2001，7(1)：52-54.[2] 林洪远，盛志勇. 全身炎症反应和MODS认识的变化及现状[J]. 中国危重病急救医学，2001，18（11）：643-646. 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