抑制Rac1的活性对人肝癌细胞生长及侵袭能力的影响

抑制Rac1的活性对人肝癌细胞生长及侵袭能力的影响作者：董朝富，周安立，陈刚，朱智，颜廷启，刘顺方　刘锋，沈文状，杨志芳，易继林    作者单位：1.舟山市普陀人民医院 普外科，浙江 舟山 316100;2.温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000; 3.武汉同济医院 普外科，湖北 武汉 430022    【摘要】  目的 探讨抑制人肝癌细胞HepG2中Rac1的活性对其生长及侵袭能力的影响。方法 应用逆转录病毒载体，将Rac1基因的阴性突变体Rac1N17导入HepG2细胞，经嘌呤霉素筛选后获得表达Rac1N17的阳性细胞克隆Rac1N17-HepG2，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞增殖抑制并绘制细胞生长曲线，细胞基质黏附实验检测对细胞的黏附能力的影响，Transwell法检测细胞侵袭能力的改变。结果 荧光镜下可见绿色荧光蛋白主要分布于HepG2细胞核中，在细胞质中也有少量表达，证实了病毒载体质粒转染成功。MTT法表明Rac1的活性抑制后，HepG2细胞的增殖能力无明显变化(P>0.05);细胞基质黏附实验显示HepG2细胞与基质的黏附能力随着时间的延长而逐渐减弱(P<0.05);Transwell侵袭实验结果显示Rac1的活性抑制后，Rac1抑制组穿过PET滤膜的HepG2细胞数明显少于对照组(P<0.05)，表明其侵袭能力明显受抑制。结论 Rac1基因在肝癌细胞的黏附、侵袭及过程中发挥重要的作用，有望成为肝细胞癌基因治疗新的靶点。    【关键词】  Rac1;癌，肝细胞;逆转录病毒载体;侵袭　　Effect of the activity of Rac1 gene restrained in HCC on its proliferation and invasive ability DONG Chaofu*， ZHOU Anli*， CHENG Gang， et al. * The People’s Hospital of Putuo， Zhoushan 316100　　Abstract Objective To explore the effect of the activity of Rac1 gene restrained in HepG2 cells on its proliferation and invasive ability. Methods Dominant negative Rac1N17 was transfected into HepG2 cells with a retroviral vector pBABEGFP， which signed green fluorescent protein， HepG2 cells which expressed Rac1N17 were screen out by puromycin， then fluorescent microscope was used to observed the expression of green fluorescent protein， MTT， Cell-Matrix adhesive assay and transwell cell assay were used to test the effect of Rac1 gene restrained on the proliferation， adhesive and invasive ability of HepG2 cell， respectively. Results The expression of green fluorescent protein was mainly located on nucleolus of HepG2 cell and partly expressed in cytoplasm， which confirmed the transfected of retroviral vector. The result of MTT showed that the proliferation ability of HepG2 cell had not obvious change when Rac1 gene was restrained (P<0.05). Rac1 gene restrained could reduce the adhesive ability of HepG2 cell (P<0.05). Transwell invasion assay showed the invasion ability of HepG2 cell was weakened in Rac1N17-HepG2 cells than that in BABE-HepG2 cells and HepG2 cells (P<0.05). Conclusion Rac1 gene plays an important role in adhesive and invasive ability of HepG2 cell， and it may be the new target of the gene therapy of HCC.　　Key words Rac1; carcinoma， hepatocellular; retroviral vector; invasion　　肿瘤细胞的转移和侵袭能力是导致肿瘤复发的重要原因之一，在影响肿瘤细胞侵袭转移行为的诸多因素中，Rho样小GTP酶Rac1通过调节肌动蛋白细胞骨架，促进细胞运动，而在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用[1]，目前研究发现Rac1在多种肿瘤标本及细胞系中存在着高表达，且其表达水平与肿瘤的侵袭和转移密切相关[2-5]。我们的前期实验也已证实Rac1基因蛋白在肝细胞癌组织标本中表达明显增高，且其高表达与肿瘤的侵袭、转移密切相关[6]。本实验中我们通过逆转录病毒载体介导的Rac1阴性突变体抑制人肝癌细胞HepG2中Rac1的活性，探讨其对肝癌细胞生长及侵袭能力的影响。1 材料和方法　　1.1 材料与试剂 带Rac1阴性突变体且标志绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体pBABEGFPRac1N17及只带有绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体pBABEGFP质粒由法国蒙比利埃大学的pierre roux教授惠赠，病毒包装细胞PA317及小鼠成纤维细胞株NIH3T3由同济医学院免疫教研室提供，人肝癌细胞株HepG2由本室保存。阳离子脂质体Lipofectin Amine2000购于美国Invitrogen公司，嘌呤霉素购于Sigma公司，MTT、DMSO、polybrene(聚凝胶)均购于Sigma公司，Transwell购自美国Corning公司，基质Matrigel 胶美国BD公司产品。　　1.2 逆转录病毒的包装 pBABEGFPRacN17质粒DNA经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，Lipofectin 2000脂质体介导转染PA317包装细胞。经嘌呤霉素(2.0 ?滋g/ml)筛选，待10~14 d抗性克隆形成后传代培养。细胞长满培养瓶底部时，收集24 h的培养液，经孔径为0.45 ?滋m的无菌滤膜过滤，所得即为病毒感染液。病毒滴度测定采用感染NIH3T3细胞株，参见文献[7]。同样方法包装载体pBABEGFP质粒作为实验对照。　　1.3 逆转录病毒感染HepG2细胞 80%汇合的HepG2细胞加入pBABEGFPRacN17病毒上清和pBABEGFP病毒上清，加polybrene至终浓度为8 ?滋g/L，5% CO2，37℃下培养12 h后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养液换液终止感染。再经含嘌呤霉素(终浓度为2.0 μg/ml)的培养液筛选直至形成抗性克隆。荧光显微镜下观察感染后HepG2细胞GFP的表达，挑选GFP高表达的克隆继续传代培养，即得转染Rac1阴性突变体的HepG2细胞。将pBABEGFPRac1N17病毒上清和pBABEGFP病毒上清感染的HepG2细胞分别命名为Rac1N17-HepG2细胞和BABE-HepG2细胞。　　1.4 细胞生长曲线绘制 取对数生长期的各组HepG2细胞：实验组为Rac1N17-HepG2细胞，阴性对照组为BABE-HepG2细胞，空白对照组为HepG2细胞;5 000个/孔接种于96孔培养板，培养24 h待细胞贴壁后吸弃培养基。每组设6个复孔，每孔体积200 μl，在37℃ 5% CO2孵箱中培养，分别在接种后第1，2，3，4天取细胞进行MTT比色试验：每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，孵育4 h后终止培养，吸弃上清，加入150 μl DMSO，振荡10 min，用酶联免疫检测分析仪测定吸光度A490 nm值，以只加培养液，不加细胞的空白对照孔调零，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制各组细胞的生长曲线。　　1.5 细胞黏附实验 取96孔培养板，先用Matrigel胶1 μg/孔包被，在37℃ 5% CO2孵箱中孵育1 h，再用2%牛血清白蛋白孵育1 h，备用。三组细胞，每组设6个复孔;将上述细胞悬液分别接种于处理过的96孔板内，5×104个细胞/孔，分别于37℃ 5% CO2孵箱中孵育30 min、60 min、90 min和120 min后弃去未黏附细胞，用PBS液冲洗2次，对照孔不洗，分别在不同的时间加入5 g/L的MTT溶液20 μl，培养4 h后再依次加入DMSO 150 μl，酶联免疫检测分析仪检测490 nm处的吸光值。　　1.6 细胞侵袭分析 细胞侵袭实验在transwell小室中进行，所有器皿及试管均事先预冷，并将matrigel胶预先置4℃融化，用无血清培养基将其1∶3稀释、混匀，75 μl/孔加至聚碳酸酯膜上，再将小室放在24孔培养板的孔内，整个操作在冰上及无菌条件下进行，37℃放置2 h，每孔再加50 μl含(10 g/L)BSA的无血清培养基，37℃放置2 h，备用。三组细胞每组设3个复孔，在下室加NIH3T3条件培养液200 μl /孔，于37℃ 5% CO2条件下培养24 h，弃去上室中的培养液，将小室浸泡于95%乙醇中固定15 min，冲洗两遍后将小室在吉姆萨染液中染色15 min，并用生理盐水棉签轻擦去上室的胶，然后将膜切下， 脱水、透明后，固定于载玻片上，在倒置显微镜下观察迁移到膜下的细胞数。计数方法：在400×视野下任取5个不重复视野，利用目镜测微尺计数每个视野穿透胶的细胞数目。　　1.7 统计学方法 数据以均数±标准差表示，组间差异比较用SPSS12.0软件包进行单因素方差分析及重复测量数据的方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。2 结果　　2.1 HepG2细胞的逆转录病毒感染 含有重组逆转录病毒的PA317包装细胞培养上清感染NIH3T3细胞后，pBABEGFPRacN17和pBABEGFP的病毒滴度分别为1.6×106和1.5×106个感染病毒颗粒/ml。逆转录病毒pBABEGFPRacN17和pBABEGFP感染HepG2细胞后，荧光显微镜检测GFP的表达(见图1)。　　2.2 细胞生长曲线及增殖能力的检测 经过4 d培养，不同时段的检测，绘制了肝癌细胞系HepG2细胞的生长曲线(见图2)，结果显示前两天各组细胞生长曲线基本保持一致，从第3天起Rac1N17-HepG2组细胞的生长速率稍慢于BABE-HepG2组细胞和HepG2组但三者之间均无明显差异(P>0.05);第4天开始各组生长速率开始减慢，各组间仍无明显差异(P>0.05)。结果表明Rac1N17阴性突变体抑制HepG2细胞中Rac1基因表达对细胞增殖无抑制作用。　　2.3 细胞黏附能力的检测 各组细胞培养30 min、60 min、90 min、120 min后，不同时间段检测细胞黏附率。结果显示90 min和120 min时Rac1N17-HepG2组的黏附细胞的吸光度值较BABE-HepG2组和HepG2组明显降低，其差异均有统计学意义(P<0.05)，而后二者之间无明显差异(P>0.05)。表明随着时间的延长，HepG2细胞中Rac1基因的抑制使细胞的黏附能力明显降低(见表1)。　　2.4 细胞侵袭能力的检测 Transwell实验中细胞侵袭穿过重建Matrigel的能力反映该细胞的侵袭能力。结果显示48 h后Rac1N17-HepG2组侵袭的相对细胞数目为(32.07±4.25)个，明显少于BABE-HepG2组的(53.21±6.12)和HepG2组的(49.73±4.81)个，其差异均有显著统计学意义(P=0.009及P=0.015)(见图3)。3 讨论　　肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内其发病率在所有恶性肿瘤中为第5位而致死率则排在第3位，每年约有超过100万的新增病例，肝细胞癌预后较差，其原因主要归咎于肿瘤具有极强的侵袭、转移能力。HCC的侵袭、转移机制非常复杂，涉及多种黏附分子、基质蛋白酶、细胞因子以及相应的信号转导机制和相关的基因改变。　　Rac1是小G蛋白Rho家族成员，是细胞黏附、颗粒释放和细胞毒性作用的重要调节因子，在多种类型细胞骨架蛋白重构和特异性基因表达中起调控作用[8]，它也是肿瘤侵袭转移过程中重要的信号传导分子。目前已经发现Rac1在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌及卵巢癌中表达明显增高，且其高表达与肿瘤的侵袭转移密切相关，在肝细胞癌中RacGTP酶的激活可上调肿瘤细胞中VEGF的表达，并最终影响肿瘤的转移及血管生成[9]，我们的前期实验也已证实Rac1基因蛋白在肝细胞癌组织标本中表达明显增高，且其高表达与肿瘤的侵袭、转移密切相关[6]。Rac1蛋白影响肿瘤细胞侵袭转移的可能机制为：促进细胞表面整合素家族在细胞头部募集，将调节信号传递到肌动蛋白细胞骨架，诱导肌动蛋白微丝在质膜上聚集，产生片状伪足及膜多极化[10-11];活化其下游的一个重要调节因子——凝溶胶蛋白(gelsolin)，利用凝溶胶蛋白的F-肌动蛋白分离活性，破坏肌动蛋白细胞骨架，影响细胞的运动及侵袭力[12];另外，还可能与下游的血小板源性生长因子信号途径、百日咳毒素敏感性G蛋白及cAMP依赖性途径有关。　　在本实验中，通过利用逆转录病毒载体介导的绿色荧光标志的Rac1阴性突变体，将其转染肝癌细胞HepG2，检测其对肝癌细胞生长及运动、侵袭能力的影响。pBABEGFPRac1N17是由法国蒙比利埃大学的pierre roux教授构建，它在细胞中表达后可显著抑制细胞中Rac1的表达活性[13]。本研究结果显示：病毒载体质粒转染HepG2细胞48 h后，荧光镜下可见GFP-Rac1N17融合蛋白(绿色)主要分布于细胞核中，在细胞质中也有少量表达，证实了病毒载体质粒转染成功。MTT法、细胞基质黏附实验、细胞侵袭实验结果表明：Rac1的活性抑制后，人肝癌细胞HepG2细胞的增殖能力无明显变化;而HepG2细胞与基质的黏附能力随着时间的延长而逐渐减弱;同时Transwell侵袭实验结果显示Rac1的活性抑制后，实验组穿过PET滤膜的HepG2细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组，表明其侵袭能力明显受抑制。　　综上所述，抑制Rac1的活性在体外能并不能抑制人肝癌细胞HepG2细胞的增殖能力，但细胞与基质之间的黏附、侵袭能力明显受抑制，说明Rac1可能参与了肝细胞癌的侵袭与转移的调节，然而其中的具体分子机制，其上游、下游的信号传导通路的调控机制仍将是我们后续研究的重点。我们相信通过深入地研究Rac1在肝细胞癌侵袭转移过程中的机制和理论，可以为探索以Rac1为分子靶点的肝细胞癌的新的治疗策略奠定基础。【参考文献】　　[1] Hall A. 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