胆管上皮细胞分泌的VEGF-A在热缺血再灌注损伤后胆道及其微循环再生与修复中的作用

作者：孙强，余元龙，胡泽民，陈宏，吴爱国，朱晓峰    作者单位：中山大学附属中山医院，广东 中山 528403，1.普外一科，2.普外三科;3.南方医科大学附属珠江医院 普外科，广东 广州 510282;4.中山大学附属第一医院 器官移植科，广东 广州 510080

【摘要】  目的 探讨热缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)在胆道及其微循环再生与修复中的作用，为积极预防和治疗胆道热缺血再灌注损伤导致的胆道并发症提供理论依据。方法 供受体均为雄性SD大鼠。供肝分别经历0 min(对照组)和10 min(实验组)热缺血后，进行重建肝动脉血供的大鼠肝移植模型。分别于供肝冷保存后(即0 h)以及术后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、30 d处死大鼠，收集标本。测定血清ALT、GGT、TBIL。免疫组化法检测VEGF-A表达情况。分别标记胆管上皮细胞、血管内皮细胞、增殖细胞，统计汇管区胆管数、血管数以及胆管上皮细胞增殖指数。原位杂交法检测VEGF-A mRNA表达情况。结果 实验组GGT和TBIL较对照组升高持续时间更长，术后30 d和14 d才降至正常。实验组汇管区胆管数及血管数均在术后14 d达到最高值，且明显多于对照组。肝细胞和血管内皮细胞VEGF-A、VEGF-A mRNA表达在术后24 h达到峰值后迅速下降，而胆管上皮细胞VEGF-A、VEGF-A mRNA表达持续升高，直到术后7 d才达到峰值，并且实验组表达水平均强于相应时间点对照组的表达。结论 热缺血再灌注损伤后，胆管上皮细胞合成和分泌VEGF-A增加，并且可能在促进胆管及胆管周围血管丛的再生中发挥重要作用。

【关键词】  热缺血;再灌注损伤;胆管;血管内皮生长因子-A;肝移植;动物模型;大鼠

The role of vascular endothelial growth factor-A from cholangiocyte on bile duct and its microcirculation regeneration and reparation after warm ischemia reperfusion injury SUN Qiang， YU Yuanlong， HU Zemin， et al. The First Department of General Surgery， Zhongshan Hospital， Affiliated to Sun Yat-Sen University， Zhongshan 528403

　　Abstract Objective To explore the influence of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) on the bile duct and its microcirculation regeneration and reparation after warm ischemia reperfusion injury. Methods Male SD rats were used in this experiment. Rearterialized rat liver transplantation had been done after warm ischemia for 0 min (control group) or 10 min(experimental group). Six points were determined as 0 h， 6 h， 24 h， 3 d， 7 d， 14 d and 30 d post-reperfusion. Tested ALT， GGT and TBIL in serum. Expression of VEGF-A in hepatocytes， microvascular endothelial cells and biliary epithelial cells (BEC) of hepatic portal area were measured with immunohistochemistry. The sections were immunolocalized by CK19 and FⅧ-R Ag to assess the localization of bile ducts and microvessels. Bile ducts were identified by CK19 and microvessels were identified by FⅧ-R Ag. The proliferating BEC were identified with PCNA. The mRNA expression of them was determined by in situ hybridization (ISH). Results In W10 group， the levels of serum GGT and total bilirubin were evident with a longer increase than those in W0 group， and normalized at 30 d or 14 d respectively. The number of intraportal microvessels and bile ducts did not increase until at 14 d after reperfusion in experimental group and were more than control group. The expression of VEGF-A protein and its mRNA in hepatocytes and endothelial cells peaked at 24 h after reperfusion in both groups， and then reached normal level. Since 24 h after reperfusion， the expression of VEGF-A protein and its mRNA in BEC in experimental group was greater than that in control group， and peaked at 7 d after reperfusion. Conclusion VEGF-A， which is amplified in cholangiocytes， may stimulates the regeneration of bile ducts and its microcirculation after warm ischemia reperfusion injury.

　　Key words warm ischemia; reperfusion injury; bile ducts; vascular endothelial growth factor-A; liver transplantation; models， animal; rats

　　供肝热缺血再灌注损伤是导致肝移植术后胆道并发症特别是缺血型胆道疾病(ischemic-type biliary lesion，ITBL)的重要因素之一[1]。由于国内供体来源的特殊性，供肝大部分来源于心脏死亡供体(donation after cardiac death，DCD)。而由于脑死亡供体的短缺，近些年来西方国家也再次开始使用DCD来源的肝脏，并且DCD来源肝移植数量还在逐年迅速增加[2-4]。DCD均遭受了不同程度的热缺血再灌注损伤，其肝内胆管狭窄发生率(25%~50%)几乎是脑死亡供体肝移植的3倍[5-6]。因此，针对供肝热缺血再灌注损伤引起肝移植术后胆道损伤的机制及其预防和治疗措施的研究也越来越受到国内外学者的重视[5，7]。本研究将探讨热缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)在胆道及其微循环再生中的作用，为积极预防和治疗胆道热缺血再灌注损伤导致的胆道并发症提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物与分组 健康、清洁级、雄性SD大鼠共162只。体质量220~260 g，由中山大学实验动物中心提供，受体体质量略大于供体。所有大鼠被随机分为三组：假手术组(正常组)6只，仅行开腹及分离肝周韧带;0 min热缺血组(对照组)78只，其中受体及供体各36只。供体腹部正中切口进腹后立即腹主动脉插管。剪开膈肌，阻断胸主动脉，剪开下腔静脉，并立即开始经腹主动脉缓慢灌注林格氏液30 ml(含肝素钠25 U/ml)。其余6只仅行肝切除术后，将肝脏放入4℃乳酸林格氏液中保存1 h;10 min热缺血组(实验组)78只，其中受体及供体各36只。胸骨正中切口进胸。提起心脏，血管钳钳夹心脏基底部。制成心脏死亡供体热缺血模型。余下步骤与对照组相同。其余6只仅行肝切除术后，将肝脏放入4℃乳酸林格氏液中保存1 h。分别在冷保存后(即0 h)以及术后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、30 d收集标本。每组每个时间点各6只。

　　1.2 肝移植模型建立 根据Kamada N等[8]的“二袖套”法及Lahmann TG等[9]的肝动脉吻合法，支架法吻合供体腹腔动脉和受体的肝总动脉重建肝动脉血供的大鼠原位肝移植模型[10]。

　　1.3 主要试剂 鼠抗CK19单克隆抗体(产品编号：NCL-CK19)购自英国Novocastra公司;鼠抗PCNA单克隆抗体(产品编号：P8825)购自德国Sigma公司;鼠抗VEGF-A单克隆抗体(产品编号：NB100-664)购自美国Novus公司;兔抗第八因子相关抗原多克隆抗体(产品编号：RAB-0070)、免疫组化Max VisionTM检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。VEGF原位杂交检测试剂盒(产品编号：MK1142)购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.4 肝功能测定 受体大鼠处死后，从下腔静脉取血，离心。运用HITACHI/BM-717全自动生化分析仪检测血清ALT、GGT及TBIL水平。

　　1.5 免疫组化 福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片。免疫组化过程按Max VisionTM检测试剂盒说明书进行。抗原修复方法为：将切片完全浸泡于EDTA抗原修复缓冲液(pH=9.0)中，高压修复2 min。水浴冷却至室温。DAB显色，苏木素复染。CK19(稀释度为1∶75)免疫组化染色，标志胆管上皮细胞(biliary epithelial cells，BEC);第八因子相关抗原(稀释度为1∶200)免疫组化染色，标志血管内皮细胞。PCNA(稀释度1∶500)免疫组化染色，标志增殖细胞核。每份标本随机选取10个汇管区，计数汇管区胆管数、血管数以及胆管细胞增殖指数(增殖BEC占总BEC的比值，结果取平均值作为该张切片的增殖指数)。VEGF-A(稀释度为1∶100)免疫组化染色评价VEGF-A蛋白表达。

　　1.6 原位杂交检测VEGF-A mRNA的表达 4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)溶液固定，石蜡包埋，切片。原位杂交检测VEGF-A mRNA的表达。针对大鼠VEGF靶基因的mRNA序列为：①5′-TACCT CCACC ATGCC AAGTG GTCCC AGGCT GCACC-3′;②5′-ATTGA GACCC TGGTG GACAT CTTCC AGGAG TACCC-3′;③5′-GTCAC TATGC AGATC ATGCG GATCA AACCT CACCA-3′。按原位杂交检测试剂盒说明书行原位杂交。NBT/BCIP显色，核固红复染，充分水洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性表达为蓝紫色或蓝黑色，核着色为红色。

　　1.7 统计学方法 所有数据应用SPSS13.0软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组间均数的比较利用两独立样本的t检验。

　　2 结果

　　2.1 肝功能 肝移植术后，对照组及实验组ALT明显升高，且均在术后6 h达到最高峰，随后逐渐降低。对照组术后3 d降至正常，实验组也在术后7 d降至正常。但与ALT相比，GGT和TBIL达到最高值和恢复正常的时间都比ALT晚。对照组GGT和TBIL均在术后24 h达到最高值，术后第7天恢复正常。实验组GGT和TBIL在术后24 h后仍然继续升高，到术后3 d达到最高值，术后30 d和14 d才降至正常(见表1)。

　　2.2 汇管区胆管数量变化 正常大鼠肝脏每个汇管区平均有2.59个胆管(包括小叶间胆管和Hering管)。Hering管局限于汇管区内，位于汇管区边缘。未见Hering管穿过界板进入肝实质。肝实质内未见CK19阳性细胞。术后24 h，对照组和实验组平均每个汇管区的胆管数量较正常肝脏增加，但两组之间的差异没有统计学意义。术后3 d、7 d、14 d，汇管区胆管数量持续增加，到术后14 d达到最高值。其间实验组汇管区胆管数量明显多于对照组(见表2)。

　　2.3 汇管区血管数量变化 正常大鼠肝脏平均每个汇管区有2.96个血管。对照组术后6 h和24 h汇管区血管数量与正常肝脏比较不存在统计学差异。但实验组术后6 h和24 h汇管区的血管数量较对照组相应时相点和正常肝组织均明显减少。虽然实验组术后7 d血管增生，汇管区血管数量有所增加，但仍明显少于对照组。到术后14 d汇管区血管数才达到峰值，实验组汇管区血管数明显多于对照组(见表2)。

　　2.4 胆管上皮细胞增殖指数变化 正常肝脏少见增殖BEC。肝移植术后6 h，BEC即出现明显的增殖，BEC增殖指数迅速升高。术后24 h增殖最明显，实验组明显高于对照组。此后，对照组BEC增殖指数逐渐下降，至术后30 d降至正常水平。但是，实验组在术后3 d有所下降之后，于术后7 d再次升高达到27%(见表2)。

　　2.5 VEGF-A蛋白及VEGF-A mRNA表达 免疫组化及原位杂交结果显示：正常及冷保存后的大鼠BEC、肝细胞、血管内皮细胞VEGF-A、VEGF-A mRNA表达阴性或仅有微量表达。对照组及实验组术后肝细胞及血管内皮细胞VEGF-A、VEGF-A mRNA表达均在术后24 h达到高峰，分别为弱阳性和中度阳性表达。之后VEGF-A、VEGF-A mRNA表达量逐渐下降，对照组和实验组分别在术后3 d和7 d恢复至正常水平。术后6 h，对照组及实验组BEC仅微量表达VEGF-A、VEGF-A mRNA，较正常及冷保存后表达无明显增加。此后，BEC表达VEGF-A、VEGF-A mRNA逐渐增加，到术后第7天达到高峰，且实验组表达水平均强于相应时间点对照组表达水平。对照组表达为中度阳性，实验组表达为强阳性(见图1)。

　　3 讨论

　　VEGF是Ferrara于1989年从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离纯化的，具有促血管内皮细胞有丝分裂活性的糖基化多肽分泌因子，命名为VEGF，也称血管通透因子。其生物学效应主要包括促进内皮细胞有丝分裂、诱导血管内皮细胞的增殖和迁徙、增加血管的通透性等。但是现在发现，VEGF及其受体的表达并非仅局限于血管内皮细胞中，目前已知在血管平滑肌细胞、成骨细胞、再生肌管以及造血干细胞中均有表达。另外，在许多正常的上皮细胞中亦有VEGF的表达[11-14]。

　　最近Gaudio等发现正常BEC亦表达VEGF-A。胆总管结扎后，胆管上皮细胞合成和分泌VEGF-A增加，并且通过自分泌促进其自身的增殖[15-16]。结扎胆总管的同时结扎肝动脉后，胆管周围血管丛消失，汇管区胆管增生反应、纤维化以及VEGF-A表达均较单纯胆总管结扎后降低。给予γ-VEGF-A后，上述指标恢复至单纯胆总管结扎时的水平。本研究中，我们发现正常BEC也存在着少量的VEGF-A表达，这与之前的研究是一致的[15]。

　　我们发现，热缺血再灌注损伤后BEC迅速增殖，在术后24 h增殖最明显。虽然术后3 d BEC增殖指数有所下降，但是术后7 d BEC增殖指数再次升高。热缺血再灌注损伤后汇管区胆管数量亦持续增加，术后14 d，汇管区胆管数最多。与BEC早期即出现明显增生不同，术后7 d，汇管区血管数仍未见明显增生，直到术后14 d汇管区血管数才明显增加，这与实验组GGT及TBIL恢复正常的时间基本一致。

　　与胆总管结扎不同，胆道在遭受热缺血再灌注损伤的同时，汇管区血管内皮细胞也同样遭受了热缺血再灌注损伤。但是我们发现，热缺血再灌注损伤后，肝细胞及汇管区内皮细胞表达的VEGF-A在再灌注后24 h即达到最高值，之后迅速恢复至正常水平。在再灌注24 h后的各时间点，BEC的VEGF-A表达量均强于肝细胞和内皮细胞，且在术后7 d达到高峰。因此，BEC增殖指数再次升高以及术后14 d汇管区血管数明显增加可能与BEC持续高表达VEGF-A有关，BEC分泌的VEGF-A可能促进了胆管及其微循环的再生与修复。

　　总之，BEC分泌的VEGF-A可能在促进胆管及PBP再生中发挥着重要的作用。那么，利用γ-VEGF-A或以干细胞为载体使汇管区高表达VEGF-A，是否会促进胆道及其微循环的再生，降低供肝热缺血再灌注损伤导致的胆道并发症的发生率呢?这也是我们需要进一步探讨的问题。

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