PTTG和VEGF在原发性胆囊癌中的表达及意义

    作者：张耀明，彭广福，宋越，张彩云，马伟，徐继威    作者单位：广东省梅州市人民医院 普外一科，广东 梅州 514031

    【摘要】  目的 探讨垂体肿瘤转化基因（pituitary　tumor　transforming　gene，PTTG）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在原发性胆囊癌中的表达及相互关系，研究其表达与肿瘤临床病理指标及预后的联系。方法 应用免疫组织化学法，检测41例原发性胆囊癌及20例慢性结石性胆囊炎中PTTG和VEGF的表达水平。结果 在原发性胆囊癌中PTTG和VEGF阳性表达率分别为85.4%和56.1%，其阳性率及表达等级均明显高于慢性胆囊炎中的表达情况，差异均有统计学意义(P<0.05)。PTTG和VEGF表达等级均与胆囊癌的Nevin分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)；PTTG表达与VEGF表达呈正相关（r＝0.526，P<0.05）。PTTG或VEGF阳性患者的累积生存期明显低于阴性者(P<0.05)。结论 PTTG或VEGF与胆囊癌生物学行为及预后关系密切，PTTG表达与VEGF表达呈明显正相关。二者的联合检测，有助于原发性胆囊癌恶性程度和预后的判断，以进一步指导临床诊疗。

    【关键词】  胆囊肿瘤；垂体肿瘤转化基因；血管内皮生长因子；免疫组织化学

    Expression of PTTG and VEGF in primary gallbladder cancer and their clinical significance 

    ZHANG Yaoming， PENG Guangfu， SONG Yue， et al. The First Department of General Surgery， Meizhou People’s Hostipal， Meizhou， Guangdong 514031

    Abstract   Objective  To investigate the expression and their relationship between PTTG (pituitary tumor transforming gene) and VEGF (vascular endothelial growth factor) in primary gallbladder cancer， as well as the relationship of their expression with clinical-pathological indexes and prognosis in primary gallbladder cancer. Methods  PTTG and VEGF were examined in 41 cases of primary　gallbladder cancer and 20 cases of chronic calculous cholecystitis tissues with immunohistochemical assay. Results  The positive rate of PTTG and VEGF was 85.4%　and　56.1% respectively in gallbladder cancer， whose positive expression rate and expression grade were singnificantly higher than that in chronic cholecystitis tissues (P<0.05). The expression　grade　of PTTG　and　VEGF was significantly correlated to the Nevin staging and lymph node metastasis of gallbladder cancer (P<0.05)： positive expression rate and expression　grade of PTTG and VEGF increased with progression of Nevin stage； positive expression rate of PTTG and VEGF for patients who had lymph node metastasis was obiviously higher than that of no lymph node metastasis. Expression of PTTG was positively correlated with the expression of VEGF (r=0.526， P<0.05). The PTTG or VEGF positive patients had a shorter survival time than that of PTTG or VEGF negative ones (P<0.05). Conclusion  PTTG or VEGF is highly related to the biological behavior and prognosis of gallbladder cancer， expression of PTTG is positively correlated with the expression of VEGF. Associated detection of PTTG and VEGF may help to judge the malignant degree and prognosis of primary gallbladder cancer， and further instruct its diagnosis and treatment.

    Key words   gallbladder neoplasms； pituitary　tumor　transforming　gene； vascular endothelial growth factor； immunohistochemistry

    原发性胆囊癌临床过程隐匿，转移早，侵袭力强，预后不佳。如何从分子生物学水平判断其恶性程度、浸润转移倾向及预后关系，以指导临床诊疗和改善患者预后，倍受人们关注。新近发现的原癌基因垂体肿瘤转化基因（pituitary　tumor　transforming　gene，PTTG）高表达在促进细胞增殖、转化、肿瘤发生发展中起着十分重要的作用[1]。PTTG高表达与一些恶性肿瘤生物学行为及预后有密切关系，并能诱导VEGF及其受体KDR/FIK-1，bFGF及其受体FGF-R-1的表达，从而促进肿瘤血管形成[2-3]。笔者利用免疫组化技术在原发性胆囊癌病理标本中同时检测PTTG和VEGF表达情况，以探讨两者与原发性胆囊癌生物学特征及预后的关系，以及PTTG表达与VEGF表达在原发性胆囊癌中的相互关系。

    1  资料和方法

    1．1  研究对象  收集广东医学院附属医院、广东医学院附属湛江中心医院和梅州市人民医院1994年1月至2002年12月间原发性胆囊癌手术切除标本41例作为试验组，患者年龄37~80岁，平均(59.7±11.9)岁；其中男14例，女27例，男女比为1∶1.9。所有患者术前均未接受过放疗和化疗。组织类型：腺癌31例（高分化腺癌18例，低分化腺癌13例）、鳞癌6例（腺鳞癌3例，鳞状细胞癌3例）、未分化癌4例；肿瘤直径：≥2 cm 29例，＜2 cm 12例；合并胆囊结石情况：合并者33例，未合并8例； Nevin分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期7例、Ⅲ期9例、Ⅳ期14例、Ⅴ期9例；淋巴结转移情况：未转移24例，转移17例；手术方式：单纯胆囊切除术2例、根治性切除术28例、扩大根治性切除术5例、剖腹探查及活检术6例；术后随访情况：完整数据28例、截尾数据6例、失访7例，生存期1~46个月，中位存活时间9.3个月。另取手术切除慢性结石性胆囊炎标本20例作为对照组，患者年龄20~71岁，平均（51±14.5）岁；其中男7例，女13例，男女比为1∶1.9。20例慢性结石性胆囊炎患者全部行单纯胆囊切除术，未统计生存时间。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 ?滋m厚连续切片，经HE染色，病理确诊。

    1．2  主要试剂  特异性一抗兔抗人PTTG多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色系统购自福州迈新生物技术公司。PTTG多抗及VEGF单抗的工作浓度均为1∶100。

    1．3  研究方法  采用SP免疫组化技术，主要步骤如下：切片常规脱蜡和水化后，以柠檬酸缓冲液高温高压修复抗原，用3% H2O2作用10 min，除去内源性过氧化物酶，以稀释的羊血清封闭10 min，加入一抗在湿盒中4℃过夜，PBS洗涤后加生物素标志的二抗，第二代辣根酶标记链酶菌素工作液孵育各10 min，BPS冲洗3次，最后在DAB溶液中显色5 min，自来水冲洗，苏木素复染，乙醇梯度脱水，封片观察。

    1．4  结果判断  所有病例免疫标志结果的分析，均在不知临床资料的情况下，由两名经验丰富的病理医师进行判断，并取得一致意见。阳性细胞必须具备：细胞结构清晰，阳性染色定位准确，着色明显高于背景。结果判断采用半定量积分法，根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅计数。阳性细胞比例1/3以下为1分，1/3～2/3为2分，2/3以上为3分；细胞无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据二者乘积判断阳性等级：0分为阴性（－），1～2的为弱阳性（＋），3～4分为阳性（＋＋），大于4分为强阳性（＋＋＋）。以已知PTTG和VEGF阳性的结肠癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

    1．5  统计学方法  应用SPSS10.0统计软件包对结果进行等级资料秩和检验（成组设计两样本比较的Wilcoxon法，成组设计多个样本比较的Kruskal-Wallis法）；Spearman等级相关分析；积累生存率作出Kaplan-meier生存曲线，采用Long-rank检验(检验水准α＝0.05)。

    2  结果

    2．1  PTTG及VEGF的表达特征和阳性率  二者阳性表达均定位于肿瘤上皮细胞的胞质，呈弥漫性全胞质分布，偶见胞核表达。胆囊癌灶中为弥漫性或灶性分布，肿瘤间质及炎症细胞少见不规则弱阳性分布。41例胆囊癌组织中PTTG阳性表达35例，其阳性率为85.4%；VEGF阳性表达23例，阳性率为56.1%。对照组除PTTG及VEGF各有4例表达弱阳性(+)、l例VEGF表达阳性(++)外，其余均为阴性。良恶性病变表达等级差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

    2．2　 PTTG及VEGF与胆囊癌临床病理指标关系

    胆囊癌组织PTTG和VEGF表达等级均与Nevin分期及淋巴结转移有关：随着病期发展PTTG和VEGF阳性表达率及半定量分级逐渐升高(P<0.05)；有淋巴结转移者PTTG和VEGF表达水平与无淋巴结转移者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而PTTG和VEGF表达等级均与病理类型、肿瘤直径、合并胆石情况等无关(P＞0.05)(见表2)。作Spearman等级相关分析结果表明PTTG在胆囊癌中表达水平与VEGF表达情况呈正相关（r＝0.526，P<0.05）(见表3)。

    2．3  PTTG及VEGF表达与胆囊癌预后关系  TTG、VEGF阳性表达患者的半数存活时间分别为6个月和5个月，而阴性表达患者分别为25个月和13个月，Long-rank检验提示PTTG、VEGF阳性表达患者生存期明显短于阴性患者，差异均有统计学意义(P<0.05) (见图1，2)。

    3  讨论

    PTTG定位于染色体5q33，该基因全长超过10 kb，含有5个外显子和4个内含子，是编码一个含202个氨基酸残基、分子量为22 kd的蛋白质。人体的多种正常增生性组织，如胚胎肝、正常成人大脑、脾脏、睾丸等存在PTTG的低表达，在多种肿瘤细胞系如早幼粒白血病细胞HL-60、乳腺癌细胞MCF-7等中发现PTTG高表达[1]。Zhang等[4]用RT-PCR等方法检测54例脑垂体肿瘤及其正常脑垂体组织后发现，有46例脑垂体肿瘤PTTG mRNA含量高于对照组50%，有的甚至高达10倍以上。其中23例分泌型脑垂体肿瘤中，浸润至碟骨的肿瘤（临床Ⅲ、Ⅳ期）PTTG mRNA表达明显高于病变局限在垂体窝的肿瘤（临床Ⅰ、Ⅱ期），差异有统计学意义。研究还发现PTTG mRNA高表达与结直肠癌、食管癌的发生及肿瘤病理分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，并与食管癌的预后密切相关[5-6]。这些结果均提示，PTTG高表达可能与肿瘤的生长、浸润、转移和预后有关。VEGF是体内最强的血管生成因子，能特异性地与血管内皮细胞结合，促进其增生形成新生血管。杨竹林等[7]利用免疫组化方法研究发现VEGF表达与胆囊癌生物学行为、转移发生及预后密切相关。本实验中，原发性胆囊癌组织中PTTG、VEGF阳性表达均高于对照组，其阳性率和表达等级两组间差异有统计学意义(P<0.05)，PTTG和VEGF表达等级均与胆囊癌Nevin分期和淋巴结转移有关(P<0.05)，而与其他因素无关。该结果提示高表达的PTTG和VEGF可能与原发性胆囊癌的发生发展密切相关，其机制可能是PTTG高表达直接引起细胞转化，导致原发性胆囊癌的发生[1]；VEGF可能通过自分泌或（和）旁分泌作用于肿瘤细胞，直接促进其生长，并通过诱导血管的形成，增强血管通透性，为肿瘤提供营养物质，间接调控肿瘤生长和转移。本组资料显示胆囊癌中PTTG或VEGF阳性的病例累计生存期显著低于PTTG或VEGF阴性者，差异均具统计学意义(P<0.05)。因此，PTTG、VEGF高表达不仅可能是胆囊癌浸润和转移的分子生物学标志，而且有希望作为反映胆囊癌预后不良的指标。

    恶性肿瘤的发生、发展是一个涉及到多基因、多水平变化的多阶段过程，在此过程中不同因素对细胞产生协同作用增加了细胞的癌变。研究发现在垂体肿瘤中同时存在PTTG及VEGF高表达情况[2]，但二者在恶性肿瘤表达中是否存在关联性尚未见报道。本组资料显示，在胆囊癌中PTTG的表达与VEGF表达呈明显正相关关系（r＝0.526、P<0.05），提示在胆囊癌的发生、发展、浸润转移过程中，PTTG表达与VEGF表达可能具有相互诱导、调节和协同作用，其机制尚有待于进一步深入研究。

【参考文献】[1] Zhang X， Horwitz GA， Prezant TR， et al. Structure，expression，and function of human pituitary tumor transforming gene(PTTG)[J]. Mol Endocrinol，1999，13（1）：156-166.

[2] McCabe CJ， Boelaert K， Tannahill LA， et al. Vascular endothelial growth factor，its receptor KDR/FIK-1，and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumors[J]. J Clin Endocrinol Metab，2002，87(9)：4238-4244.

[3] Boelaert K， McCabe CJ， Tannahill LA， et al. Pituitary tumor transforming gene and fibroblast growth factor-2 expression： potential prognostic indicators in differentiated thyroid cancer[J]. J Clin Endocrinol Metab，2003，88(5)：2341-2347.

[4] Zhang X， Horwitz GA， Heaney AP， et al. Pituitary tumor transforming gene(PTTG) expression in pituitary adenomas[J]. J　Clin Endocrinol Metab，1999，84(2)：761-767.

[5] Heaney AP， singson R， McCabe CJ， et al. Expression of pituitary-tumor transforming gene in colorectal tumours[J]. Lancet，2000，355(9205)：716-719.

[6] Shibata Y， Haruki N， Kuwabara Y， et al. Expression of PTTG(pituitary tumor transforming gene) in esophageal cancer[J]. Jpn J Clin Oncol，2002，32(7)：233-237.

[7] 杨竹林，李永国，钟德玝，等. 胆系恶性肿瘤VEGF，bFGF的表达与微血管计数的关系[J]. 中华普通外科杂志，2000，15（9）：558-561.