Survivin蛋白在肝门部胆管癌中的表达及其与p53相关性的研究
发表时间：2009-09-29 浏览次数：521次
作者：荆涛 曲辉 智绪亭 作者单位：山东大学齐鲁医院 普外科 （山东 济南 250012）
【摘要】 目的：检测肝门部胆管癌中凋亡抑制因子Survivin蛋白的表达，研究其与肝门部胆管癌的临床特征的关系，并探讨其与p53的相关性。方法：采用免疫组织化学方法检测86例肝门部胆管癌组织、10例癌旁组织（距肿瘤边缘约1.0cm）及10例正常胆管组织中Survivin蛋白和p53蛋白的表达，结合临床病理学资料进行统计学分析。结果：86例肝门部胆管癌组织中，Survivin蛋白阳性率为82.6% （71/86），p53蛋白阳性率为76.7% （66/86），Survivin与p53在癌旁组织和正常胆管组织中均呈阴性表达，与癌组织相比差异有统计学意义（P<0.05）；Survivin表达与肝门部胆管癌病理分级、Bismuth分型、患者的性别及年龄和肿瘤大小均无关（P>0.05），但淋巴结转移阳性组Survivin蛋白表达水平明显高于淋巴结转移阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）；p53蛋白在肝门部胆管癌中与肿瘤组织病理分级、淋巴结有无转移相关（P<0.05），与其他病理学特征无关（P>0.05）。71例Survivin阳性表达者中同时表达p53阳性者58例，15例阴性表达者中表达p53阳性者8例，两者差异有统计学意义（P <0.05）。结论：肝门部胆管癌组织中Survivin和p53的表达显著高于癌旁组织和正常胆管组织，其在肝门部胆管癌的发展、转移过程中可能具有重要作用。
【关键词】 胆管肿瘤 · Survivin ·蛋白质p53 ·免疫组织化学
Expression and implication of Survivin and its correlation with p53 in hilar cholangiocarcinoma
JING Tao , QU Hui , ZHI Xu-ting
Department of General Surgery，Qilu Hospital，Shandong University（Jinan 250012，China）
【ABSTRACT】 Objective:To investigate the expression of Survivin and its relationship with the clinical features of hilar cholangiocarcinoma and the expression of p53. Methods: The expressions of Survivin and p53 were detected in 86 specimens of hilar cholangiocarcinoma,10 specimens of tissues near the carcinoma and 10 specimens of normal bile duct tissues by immunohistochemistry method.Laboratory data were analyzed with the related clinical-pathological data. Results: Survivin was expressed in 71（82.6%） cases of 86 cases. p53 was expressed in 66（76.7%） cases. Survivin and p53 were not detected in tissues near the carcinoma and normal bile duct tissues. The expression of Survivin in hilar cholangiocarcinoma had no association with age and gender（P＞0.05）, tumor size（P＞0.05）, the Bismuth type（P＞0.05）, pathological grading（P＞0.05）,but the expression was closely related with lymph node metastasis（P<0.05）. The expression of p53 in hilar cholangiocarcinoma was closely related with pathological grading and lymph node metastasis（P<0.05）, but the expression had no association with age and gender（P＞0.05）, tumor size（P＞0.05）, the Bismuth type（P＞0.05）. p53 was expressed in 58 cases of the 71 Survivin-positive cases. p53 was expressed only in 8 cases of the 15 Survivin-negative cases.The difference had statistical significance（P<0.05）. Conclusions: The expressions of Survivin and p53 in hilar cholangiocarcinoma were significantly higher than those in tissues near carcinoma and normal bile duct tissues.Joint action of Survivin and p53 might play an important role in the oncogenesis and metastasis of hilar cholangiocarcinoma.
【KEY WORDS】 Bile duct neoplasms·Survivin ·p53·Immunohistochemistry
Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins, IAP）家族成员之一，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin蛋白抑制凋亡的机制与IAP家族其它成员相似，可直接作用于细胞色素C从线粒体向细胞质释放过程的末期，与Caspases特异性结合可接抑制终末效应蛋白Caspase-3和Caspase-7的活性（Survivin是否作用于Caspase-9，尚存争议）， 阻断细胞的凋亡过程［１］。p53基因通过参与细胞周期的负调节来调控细胞生长，诱导DNA损伤后细胞的修复或凋亡，突变后的p53则丧失正常功能。本研究应用免疫组织化学方法检测蛋白Survivin和p53在肝门部胆管癌组织中的表达，探讨其与肝门部胆管癌临床病理特征之间的关系及相互联系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集1995年1月—2007年1月山东大学齐鲁医院普外科和山东大学附属省立医院普外科行根治性切除、病理组织学检查确诊为肝门部胆管癌，且临床资料齐全的患者资料86例（齐鲁医院51例，省立医院35例），男49例，女37例；年龄32～76岁，中位年龄55岁；组织学分化：高分化19例，中分化22例，低分化45例；局部淋巴结转移：有转移57例，无转移29例；Bismuth分型：Ⅰ型16例，Ⅱ型23例，Ⅲa型9例，Ⅲb型38例。10例癌旁组织取自距肿瘤边缘约1.0 cm的组织，10例肝胆管结石患者行Roux－en－Y胆肠吻合的正常胆管组织作为对照。
1.2 主要试剂 兔抗人Survivin多克隆抗体、兔抗人p53多克隆抗体、免疫组织化学ABC试剂盒和DAB显色试剂盒均购于福州市迈新生物技术开发公司。
1.3 方法 所有标本经连续切片，厚度为5 μm，脱蜡水化，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性，切片浸入0.01mol/L的枸椽酸盐缓冲液（pH值为6.0）中，行微波加热抗原修复。应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接免疫组织化学方法,按试剂盒说明进行染色，DAB显色，苏木素复染。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 判定标准 Survivin蛋白主要表达于细胞质，p53主要表达于细胞核。以细胞质或细胞核染为淡黄色-深棕黄色、染色强度明显高于背景者为阳性；无黄色染色且显色强度与背景无明显差别者为阴性［２］。
1.5 统计学处理 应用SPSS10.0统计分析软件，采用χ2检验或精确概率法，取ɑ=0.05为显著性检验水准对资料进行分析。
2 结果
86例肝门部胆管癌组织中，71例Survivin蛋白阳性染色，阳性率为82.6%；66例p53蛋白阳性染色，阳性率为76.7%（图1，图2）。癌旁组织和正常胆管组织中Survivin与p53均呈阴性表达，与癌组织相比，差异有统计学意义（P<0.05）。Survivin表达与肝门部胆管癌病理分级、Bismuth分型、患者的性别及年龄、肿瘤大小均无关（P>0.05），但淋巴结转移阳性组Survivin表达水平明显高于淋巴结转移阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）。突变型p53蛋白在肝门部胆管癌中与病理分级、淋巴结转移有关（P<0.05），与其他病理特征无关，P>0.05（表1）。71例Survivin阳性表达者中，p53阳性表达率为81.7％（58/71），15例Survivin阴性表达者中，p53阳性表达率为53.3％（8/15），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员之一,由约1.5×103个碱基对组成，其基因定位于17号染色体q25，与EPR-l（Effector cell protease receptor-1）位于染色体的相同位置，有4个外显子和3个内含子，编码链包含与EPR-1基因互补的由426 个核苷酸组成开放阅读框架［３］。研究发现，Survivin在胚胎发育中对组织的生长起着重要的调控作用［4］。在细胞畸变和肿瘤形成时常可发现Survivin的表达。有研究报道Survivin在胆囊癌中表达， 提示Survivin在肿瘤发生发展中起重要作用［２］。本研究通过免疫组织化学方法检测Survivin在肝门部胆管癌、癌旁组织和正常胆管组织中的表达，结果显示Survivin在肝门部胆管癌中高表达，而且与肝门部胆管癌病理分级、Bismuth分型、患者的性别及年龄、肿瘤大小均无关，而与淋巴结是否转移有显著相关性，提示Survivin可能是肿瘤高度恶性和高侵袭性的标志。Survivin阳性者具有较高的转移倾向和恶性程度，预后欠佳，应加强术后综合治疗。
p53是重要的细胞调控基因，在细胞凋亡的上游途径发挥作用，可以诱导、促进细胞凋亡。正常情况下p53蛋白的半衰期极短，用常规免疫组织化学方法不能检测，只有突变型p53蛋白因半衰期延长而在细胞核内聚集，才可以用免疫组织化学方法检测到p53的表达［５］。本研究发现，p53在肝门部胆管癌组织中的突变率达76.7%，且其表达与肝门部胆管癌Bismuth分型、患者的性别及年龄、肿瘤大小均无关，但与肿瘤病理分级、淋巴结是否转移具有显著相关性。而在癌旁组织、正常胆管组织中未检测到突变型p53蛋白，表明p53在肝门部胆管癌的发生、发展中起重要作用。
本研究发现71例Survivin阳性表达者中58例p53表达阳性，15例阴性表达者中8例p53表达阳性，提示Survivin在肝门部胆管癌组织中的表达与突变型p53集聚有关。Mirza等［６］进一步研究发现Survivin蛋白的过表达可以抑制p53诱导的细胞凋亡，因而推测Survivin在某种程度上参与了p53依赖性凋亡通路。本研究发现p53蛋白阳性肝门部胆管癌组织的Survivin表达明显高于p53蛋白阴性肝门部胆管癌组织，推测促进Survivin的表达可能是p53突变致癌的一个机制，Survivin和p53突变对凋亡抑制的协同作用可能在肝门部胆管癌的发生、发展过程中起重要作用。
Survivin作为IAP家族的新成员，因其独特的肿瘤特异性日益受到重视，Survivin参与了肿瘤发生发展的诸多环节，如：抑制细胞凋亡、促进细胞增生、与血管内皮生长因子有正协同作用促进肿瘤新生血管的生长等，以Survivin作为靶基因治疗具有重要意义［７］。目前肝门部胆管癌的临床手术切除率低，对化疗不敏感，且肿瘤处于较为特殊的解剖部位，使放疗定位困难，难以实行精确的治疗，因此肝门部胆管癌的治疗成为一大难题。由于Survivin 在肝门部胆管癌组织中表达，而在癌旁组织、正常组织中不表达, 可以采用反义技术，设计合成特异性的针对Survivin的反义寡核苷酸，脂质体介导转染肝门部胆管癌细胞，靶向抑制Survivin表达，解除其对Caspases抑制作用，促进细胞凋亡；且Survivin表达水平下降可提高肿瘤细胞对放疗及化疗药物的敏感性，为肝门部胆管癌的综合治疗提供可能性［８-９］。
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