GABRG2基因突变与特发性癫痫的相关性筛查分析

　　作者：何翔　　作者单位：重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016

　　【摘要】目的探讨GABRG2基因突变与特发性癫痫病的相关性。方法：运用PCRRFLP 对65名健康正常人和60名不同类型的特发性癫痫患者进行GABRG2基因突变及多态性研究，分别检测其外显子8(K289M)位点和外显子5(C588T)位点基因多态性。结果：在GEFS+和CAE这两组病例中发现了9例外显子8和外显子5发生突变，其余病例和正常对照组未发现有上述突变。结论：外显子8的K289M基因突变及外显子5的单核苷酸多态性(SNP)C588T 对GEFS +和CAE的临床诊断有重要的参考价值。

　　【关键词】 GABRG2基因,基因多态性,特发性癫痫

　　特发性癫痫 (idiopathic epilepsies)又称原发性癫痫或隐原性癫痫，是指没有找到明确原因的、无脑部器质性或代谢性疾病、与多个遗传因素有密切关系的、由几个微效基因的累加作用所致的一类癫痫。脑内抑制性神经递质γ氨基丁酸(GABA)与GABA受体结合后引起氯离子通道开放，氯离子内流，形成突触后抑制，与神经系统内兴奋性的机制相平衡。GABA受体由很多亚单位组成，其构象或表达异常会影响整个受体的功能，破坏神经系统内的兴奋抑制平衡，引起癫痫发作。有研究指出其中编码GABA受体γ2亚单位的GABRG2基因突变与几种特发性癫痫有关，但都是在家系中发现的，它是否有普通筛查和鉴别诊断意义尚没有统一的定论[13]。本研究着重探讨GABRG2基因外显子8上的K289M和外显子5上的C588T两个位点突变，对不同病例组的特发性癫痫和正常对照组的影响，并试图了解这些基因突变在该病散发型中的分布特点。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 收集2006年1月至12月重庆医科大学附属第一、第二医院神经内科门诊和住院的各类癫痫患者共60例，纳入标准：癫痫类型的诊断依据1989年国际抗癫痫协会提出的癫痫及癫痫综合征分类诊断标准。具体病例组有： 全面性癫痫重叠综合征伴热性发作组(GEFS+)15例(男/女为8/7)、原发性强直阵挛发作组(GTCS) 16例(男/女为8/8)、儿童失神性癫痫(CAE)14例(男/女为6/8)、继发性癫痫组(SEP) 15例(男/女为7/8)。同期选取来自重庆医科大学附属第一医院体检中心的健康体检正常人65名，男/女为34/31;均没有高热惊厥及癫痫发作史。以上人员来自重庆市及周边地区，且为无任何血缘关系的汉族人。所有研究对象均获得患者本人的知情同意。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA提取 用饱和盐析法提取外周血白细胞DNA：用红细胞裂解液溶解红细胞，3000rpm离心，弃上清液，保留管底白细胞沉淀。加入白细胞裂解液、蛋白酶K液、10%SDS，37℃水浴过夜。次日取出，加饱和氯化钠溶液沉淀蛋白质，充分震荡混匀，3000rpm 离心，转管取上清液，弃沉淀。最后用异丙醇抽提DNA， 10℃下， 4000rpm 离心取DNA，用TE溶解保存。

　　1.2.2 目的基因片段扩增 GABRG2外显子8的上游引物是：5’CACGAGTGACTCAGTTACCC3’，下游引物是：5’ATTTCAATGGTGCCAATGG3’;GABRG2的外显子5的扩增上游引物是：5’GAAAGACTGTAGGTGAGG3，下游引物是：5’GGGATCACTCTGTGTTT3。两个目的基因片段的扩增体系和反应参数均相同。总体系为50μl,依次加入10×反应缓冲液5μl，dNTPs 4μl,每种引物50pmol，模板DNA0.5ng，DNA聚合酶0.25μl，最后加双蒸水至50μl，于94℃预变性5min，然后再94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 20s，共10个循环，将退火温度改为50℃再运行24个循环。4℃低温保存PCR 扩增产物。

　　1.2.3 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP) 识别外显子8(K289M)和外显子5(C540T)突变位点的限制性内切酶分别是Nco Ⅰ和Bsam I，酶切温度及时间分别是37℃ 18h和65℃。15h，取酶切产物4μl行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(EB)染色，90V电压50min后在凝胶成像分析系统上照像并保存分析。

　　1.3 统计学处理 运用统计软件SPSS11.0首先对研究对象进行HardyWeinberg遗传平衡检验。然后对病例组和正常对照组的基因型频率差异的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 病例组与正常对照组的两个位点基因型分布 本次实验在对外显子8和外显子5的检测结果中显示：65例健康正常人均为AA型和CC型，无1例突变产生酶切位点。在60例癫痫病人中，对于外显子8有51例为AA型、9例为AT型，未发现TT型;对于外显子5有57例为CC型、3例CT型，未发现TT型。见表1。 表1 各组的两个位点基因型分布比较 注：与正常对照组比较，*P<0.05。

　　2.2 琼脂糖凝胶电泳酶切后的扩增片段 外显子8的PCR产物经酶切电泳后，没有被酶切的会出现一条307bp的电泳带，为AA型;PCR产物被酶切后出现307、177、130bp三条电泳带，为AT型;出现177bp和130bp两条带，为TT型;外显子5的PCR产物经酶切电泳后，没有被酶切的会出现一条214bp的电泳带，为CC型;PCR产物被酶切后出现214、112、102bp三条电泳带，为CT型;出现112bp和102bp两条电泳带的为TT型。见图1和图2 。

　　3 讨 论

　　特发性癫痫是由多个微效基因的累加作用所致的一种多基因疾病。大量的研究显示，约40%的癫痫患者与遗传有关[1，2]。γ氨基丁酸是脑内最重要的抑制性神经递质之一。GABA与GABA受体结合后引起氯离子内流，形成突触后抑制，与神经系统内的兴奋性机制相平衡。GABA受体由很多亚单位(如α、β、γ等)组成，其构象或表达异常均会影响整个受体的功能，破坏神经系统内的兴奋抑制平衡，并引起癫痫的发作[3，4]。

　　目前发现该受体与癫痫有关的遗传学证据为编码GABA受体γ2亚单位的GABRG基因突变的R43Q和外显子8K289M[1]。 Blaulac等对一个患有GEFS+的家系进行了观察，其突变分析显示在GABA受体γ2亚单位(GABRG2)基因中存在一致病性突变，即第289位氨基酸上的赖氨酸被蛋氨酸所替代[5]。Kananura利用单核苷酸多态性(SNPs)进行关联分析发现：CAE和高热惊厥与GABAA受体γ2亚基基因错义突变产生的无功能性的GABA受体γ亚单位有关联[6]。国内有学者研究了γ2氨基丁酸(GABA)A型受体亚单位基因GABRα5以及GABRβ3，得出二者与儿童失神癫痫(CAE)相关联[7]。类似的研究大部分是在家系中进行的，由于有遗传异质性因素，且受影响的遗传基因较多，所以对于癫痫的基因研究现在还处于一个摸索阶段。本文旨在探讨GABRG2的外显子8(K289M) 和外显子5(C588T)突变与特发性癫痫的关系是否具有普遍性。我们选取了几种常见类型特发性癫痫及继发性癫痫，研究这两个突变的基因型分布，并与正常人进行比较发现GABRG2基因外显子8(K289M) 和外显子5(C588T)突变在重庆地区有一罕见变异。

　　本次研究中，我们发现几类癫痫病例组中，GABRG2基因的外显子8和5只在GEFS+组和CAE组有突变型，且外显子8仅在GEFS+中出现突变，其余病例组和正常对照组均无突变，说明外显子8对GEFS+的鉴别诊断有较好的特异性和临床参考价值。因此，推测GABRG2可能是GEFS+的易感基因，与孟海娇等的研究结果有差异[8]。这可能和地域的遗传背景、突变位点的选择以及实验方法不同等有关。C588T的突变率较低，这一结果说明该基因的T540可能是一少见突变。另外在GEFS+和CAE组都发现了相同的外显子8和5的突变，结果显示这两种癫痫亚型可能有某种共同的发病机制。另外，在未发现突变的病例中有可能是GABRG2的其它外显子突变，例如最近有人指出GABRG2的外显子4(C592G)就是一个新的突变基因[9]，所以，该疾病的致病基因的结构和功能以及它们与潜在调控基因的相互作用机制还有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]Laes L, Ceulemans B, Audenaert D,et al.Denovo SCN1A mutation are a major cause of sever myoclonic epilepsy of infancy [J].Hum Mutat，2003，21(6)：615621.

　　[2] Haug K，Warnstedt M，Alekov AK，et al.Mutations in CLCN2 encoding a volitage gated chloride channel are associated with idiopathic generalized epilepsies [J]. Nat Genet，2003，33 (4)：527532.

　　[3]Karle J.Antisense studies of brain GABAA receptors [J].Dan Med Bull，2002，49(2)：130.

　　[4]Marini C，Harkin LA，Wallace RH，et al..Childhood absence epilepsy and febrile seizures a family with a GABA(A) receptor mutation [J].Brain，2003，126(Pt1)：230.

　　[5]Blaulac S，Huberfeld G，Isabelle GourfinkelAn，et al.First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy：a mutation in the gamma2subunit gene [J].Nat Genet，2001，28 (1)：4648.

　　[6]Kananura C，Haug K，Sander T，et al.A splicesite mutation In GABAG2 associated with childhood absence epilepsy and Febrile convulsions[J]. Arch eurol，2002，59(7)：1137.

　　[7]吕建军，陈育才，潘虹，等.五个微卫星DNA在儿童失神癫痫关联研究中的应用[J].中华医学杂志，2002，82(15)：10291032.

　　[8]孟海娇，洪震，朱国行.GABRG2基因多态性在GEFS+中分布的研究[J].Nervous Diseases and Mental Hyiene，2003，3(4)：67.

　　[9] Audenaert D， Schwartz E，Claeys KG，et al.A novel GABRG2 mutation associated with febrile seizures[J].Neurology，2006，67：687690.