碱性成纤维细胞生长因子及内皮细胞生长因子对兔韧带细胞增殖的影响

　　作者：李贤让　陈鸿辉 作者单位：1 滨州医学院附属医院关节外科 滨州市 256603;2 暨南大学附属广州市红十字会医院骨外科

　　【摘要】 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF)对内侧副韧带(MCL)和前十字韧带(ACL)细胞增殖行为的影响。方法 培养10周龄新西兰白兔内侧副韧带和前十字韧带细胞，在培养液中分别加入bFGF和ECGF，以XTT方法测定细胞的增殖行为。 结果 bFGF在1 ng/ml时即对MCL细胞有显著的促增殖作用，5 ng/ml时开始对ACL细胞有促进作用，其浓度达50 ng/ml时，对两种细胞的促进作用最大。ECGF在3.125 ng/ml时即对MCL细胞有显著的促增殖作用，其浓度达12.5 ng/ml时对ACL细胞有促进作用。bFGF和ECGF在超过其最佳作用浓度后，随浓度升高促进作用不再增强。结论 bFGF和 ECGF可以促进韧带细胞增殖进而促进韧带创伤愈合。

　　【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子;内皮细胞生长因子;韧带;细胞增殖

　　The influence of basic fibroblast growth factor and endothelial cell growth factor on　the proliferation of ligamentous cells

　　LI Xianrang1 CHEN Honghui2

　　1 Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2 Guangzhou Red Cross Hospital

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) and endothelial cell growth factor (ECGF) on the proliferation of the cells from medial collateral ligament (MCL) and anterior cruciate ligament (ACL).Medthods The MCL and ACL cells of tenweekold skeletally immature New Zealand white rabbit were cultured, while bFGF and ECGF were added to the cell culture media, the cellular proliferation was assayed by XTT method.Results The addition of 1 ng/ml bFGF enhanced the proliferation of MCL cells significantly, 5 ng/ml bFGF enhanced the proliferation of ACL cells ,this enhancement of proliferation of both MCL cells and ACL cells was maximal in the concentration of 50 ng/ml. The adition of 3.125 ng/ml ECGF enhanced the proliferation of MCL cells significantly, 12.5 ng/ml ECGF enhanced the proliferation of ACL cells.The efficacy of bFGF and ECGF declined gradually when they present at concentrations greater than the dose with the greatest efficacy.Conlusion It is evident that bFGF and ECGF can enhance the proliferation of the ligamentous cells and they can enhance the healing of ligamentous issue injuries.

　　【Key words】 bFGF, ligament,proliferation,ECGF

　　韧带损伤是膝部的常见运动创伤，尤以内侧副韧带(medial collateral ligament,MCL)和前十字韧带(anterior cruciate ligament,ACL)多见，MCL和ACL是维持膝关节稳定的重要韧带，其损伤可使膝关节丧失稳定性，引起功能障碍，甚至导致骨关节炎[21]。在中央实质部完全断裂后，MCL可自然愈合，有时不需手术介入;而ACL损伤后，即使手术缝合断端，其愈合率也较低。韧带损伤后的愈合过程与一般结缔组织相似，都经过急性炎症期、修复再生期和重塑或成熟期三个阶段[2]。研究表明[3]，在损伤韧带的局部存在着多种生长因子，它们被认为是韧带正常愈合过程的重要调节者。使用生长因子促进韧带愈合是近年来研究的焦点之一。作者通过体外培养MCL和ACL细胞，分别加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF)，以观察bFGF和ECGF对韧带细胞增殖的影响，为应用bFGF和ECGF促进韧带创伤愈合提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 bFGF(暨南大学生物医学工程研究所惠赠)，ECGF(Sigma公司产品，美国)，DMEM培养基及胰蛋白酶(Gibco公司产品)，胶原酶Ⅱ、XTT(Sigama公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),酶标仪(日本Reader)。

　　1.2 内侧副韧带和前十字韧带成纤维细胞培养 无菌切取兔龄10周新西兰白兔MCL和ACL，在含100 μg/ml PG和100 μg/ml SM双抗Hank's液中剔除滑膜等外周组织，以眼科剪剪成1 mm3左右的碎片。配制0.25%的胶原酶Ⅱ，将韧带组织移至胶原酶液中，37℃条件下消化1～2 h，组织消化后，无血清DMEM培养液冲洗，离心，以含15%胎牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，接种于一次性塑料培养瓶(Corning公司，美国)中，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱内培养。每3 d换液一次，待细胞汇合后，以胰蛋白酶消化传代。

　　1.3 XTT法测定韧带细胞增殖 收获第2～5代的MCL和ACL细胞，以5×103/孔的浓度，接种于96孔培养板上，待细胞贴壁后，分别加入1、5、10、50、100及500 ng/ml的bFGF和3.125、6.25、12.5、25、50及100 ng/ml的ECGF。对照组不加bFGF和ECGF。每组四个复孔。CO2培养箱内培养，每天观察一次。培养3 d后，每孔加入50 μl XTT(1 mg/ml)。在37℃、5%CO2培养箱内继续孵育，3 h后，在酶标仪上比色(参考波长650 nm,测量波长450 nm)，读取OD值。

　　1.4 统计学处理 实验所得数据以SPSS11.0统计软件进行分析，用方差分析和Dunnett法检验，α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 膝关节韧带细胞培养 膝关节韧带细胞贴壁时间约5～6 d，体外培养条件下，ACL细胞的增殖速度明显慢于MCL细胞;ACL细胞原代生长约需13～15 d，MCL细胞原代生长约需11～13 d。1∶2传代的细胞不超过6代时，基本上能在5～7 d内汇合成单层。ACL与MCL细胞贴壁生长，形态呈梭形，与典型的成纤维细胞形态相似(图1、2)。

　　图1 原代培养兔ACL细胞(×100) 图2 原代培养兔MCL细胞(×100)

　　2.2 bFGF对兔韧带成纤维细胞增殖的影响 表1可见，MCL和ACL各实验组OD值均大于对照组，经统计学检验，ACL各组OD值方差分析，F=28.02，P<0.01;各实验组与对照组比较，1 ng/ml组P>0.05，≥5 ng/ml各组P均<0.01。MCL各组OD值方差分析，F=90.66，P<0.01;各实验组与对照组比较均为P<0.01。表明bFGF对MCL和ACL细胞的增殖均有促进作用。1 ng/ml bFGF 即可促进MCL细胞生长，5 ng/ml bFGF 即可促进ACL细胞生长。bFGF浓度高至50 ng/ml时，其促进作用达到最大值;超过其最佳作用浓度后，随浓度升高促进作用不再增强(P>0.05)。

　　2.3 ECGF对兔韧带成纤维细胞增殖的影响 表2可见，MCL和ACL各实验组OD值均大于对照组，经统计学检验，ACL各组OD值方差分析，F=3.82，P=0.01;各实验组与对照组比较，≥12.5 ng/ml各组P值均<0.05。MCL各组OD值方差分析，F=136.06，P<0.01;各实验组与对照组比较均为P<0.01。表明ECGF 对MCL和ACL细胞的增殖均有促进作用。3.125 ng/ml ECGF 即可显著促进MCL细胞生长，浓度在12.5 ng/ml时，其促进作用达到最大值;超过其最佳作用浓度后，随浓度升高促进作用不再增强(P>0.05)。　表1 bFGF对兔韧带细胞增殖的影响表2 ECGF对兔韧带细胞增殖的影响

　　3 讨论

　　bFGF和ECGF是一些具有生物活性的多肽，具有趋化性、促有丝分裂和促进胞外基质合成的作用。它们可与细胞表面特异性受体结合，产生第二信使;第二信使可使细胞核根据特定的基因诱导或抑制基因组DNA向mRNA的转录，改变某些蛋白质的水平，进而促进DNA的复制和有丝分裂。

　　有研究表明[4，5],在韧带损伤的前两周内内源性生长因子的量和生长因子受体数目是增多的。用RTPCR技术在分子水平揭示生长因子及其受体的mRNA转录增加，故在韧带损伤的早期生长因子合成增加[3]。同样在韧带的创伤愈合过程中，存在bFGF的调节作用[6]。组织学观察证实，在韧带修复过程中成纤维细胞的增殖是第一步[7]。Schmidt等[6]报道bFGF在某一浓度范围内均可促进MCL和ACL细胞的DNA合成。Scherping等[8]报道应用大剂量的bFGF，对ACL成纤维细胞的增殖有很强的促进作用。张堂德等[9]报道，ECGF能够同时促进内皮细胞和成纤维细胞分裂、增殖，他们的研究同时表明，ECGF对内皮细胞及成纤维细胞的作用有一个最适浓度，高于或低于最适浓度，细胞的增殖能力均会降低。笔者通过培养膝关节韧带成纤维细胞，分析了外源性bFGF、ECGF对韧带成纤维细胞增殖的影响，实验表明bFGF和ECGF对兔MCL和ACL细胞具有明显的促有丝分裂活性;在某一浓度范围内对细胞增殖的影响与因子的浓度有依赖性，超过其最佳作用浓度后，增加因子的浓度，细胞增殖不再增加。以上证实bFGF、ECGF可以促进韧带成纤维细胞增殖。bFGF和ECGF对韧带细胞作用的量效关系和峰值浓度不一致，可能与MCL和ACL细胞的不同生物学特性有关。生长因子的双相性可能与肽链受体之间的亲和力有关，少量的细胞因子可在细胞膜上结合高亲和力的受体，产生链式反应，如细胞增生及合成蛋白质;而大量的细胞因子会结合更多低亲和力的受体，不能产生新的细胞甚至起相反的作用[10]。 由于韧带损伤局部存在多种生长因子，生长因子之间的相互作用还需进一步探讨。

　　近年来，随着组织工程学研究的兴起，研究人员尝试将膝关节韧带细胞与其它材料结合起来，制成具有生物活性的人工韧带。而在这种活性材料中，细胞的增殖将是十分关键的问题。如何将生长因子如bFGF、ECGF等与这些材料结合起来，也将是研究者感兴趣的问题。因而将bFGF、ECGF等应用于韧带组织工程学中，以修复韧带损伤的应用前景也将是十分广阔的。

　　【参考文献】

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　　[10] 秦岭，胡声宇，陈启明.体育生物医学基础研究与进展[M].北京：人民体育出版社, 2001:181.