兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立

　　作者：宋富波，杨牟，车海杰 作者单位：青岛大学医学院,山东 青岛 266021; 2 青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院

　　【摘要】 目的 建立小肠急性缺血再灌注损伤模型，确定合适的肠系膜上动脉阻断时间。方法 将70只新西兰兔按不同的肠系膜缺血时间(0、15、30、45、60 min)分为A、B、C、D、E共5组，每组14只。每组取8只于恢复血供2 h后留取兔下腔静脉血标本及肠组织，检测血清中丙二醛(MDA)含量的变化，光镜下观察小肠组织形态学变化并对小肠黏膜损伤程度进行评分。另6只兔用于术后24、48、72 h生存率的观察。结果 A、B、C组的术后生存率均>83.3%。C、D、E组的MDA含量及肠黏膜损伤评分与A组比较，差异均有显著性(F=12.13、280.24,P<0.01)。结论 肠系膜缺血30 min再灌注2 h是建立兔小肠急性缺血再灌注损伤的合适时间。

　　【关键词】 肠;缺血;再灌注损伤;模型,动物

　　CREATION OF THE MODEL OF ACUTE INTESTINAL ISCHEMIAREPERFUSION INJURY IN RABBITS

　　SONG FUBO, YANG MU, CHE HAIJIE

　　(Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China);

　　[ABSTRACT] Objective To create a model of acute intestinal ischemiareperfusion injury in rabbits so as to determine suitable blocking duration of superior mesenteric arteries (SMA). Methods Seventy rabbits were divided into five groups as groups A, B, C, D, and E, based on the different blocking durations of SMA for 0, 15, 30, 45 and 60 minutes, respectively, with 14 rabbits in each group. Eight of the rabbits in each group were detected for serum levels of MDA 2 h after recovery of blood supply, the changes of histomorphology of small intestine observed lightmicroscopically. The other six rabbbits in each group were used to observe the 24 h, 48 hand 72 hsurvival rates after the blockage of SMA. Results The survival rates were over 83.3% in groups A, B and C. Serum levels of MDA and score of injury of intestinal mucosa were significantly higher in groups C, D and E than that in group A (F=12.13,280.24;P<0.01). Conclusion The suitable duration for creating a model of acute SMA ischemiareperfusion injury in small bowel is ischemia for 30 minutes and reperfusion for 2 hours.

　　[KEY WORDS] intestines; ischemia; reperfusion injury; model, animal

　　缺血再灌注损伤(IRI)是指组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重，器官功能进一步恶化的临床综合征[1]。IRI具有种属、器官的普遍性和广泛性，在临床上常见于动脉阻塞性疾病治疗过程中、器官移植、术中血流阻断、休克、心肺复苏等情况。IRI对器官的功能和组织结构都可以造成明显的损伤，甚至引起急、慢性器官衰竭[2]。临床上肠系膜缺血性疾病具有诊断困难、预后差、病死率高的特点。本研究旨在探索建立急性肠道IRI模型的条件，为研究如何减轻甚至阻止肠道IRI提供工具。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物及分组

　　健康封闭清洁级雄性新西兰兔，体质量2.0～2.5 kg。动物饲养于干净、清洁、20～22 ℃的环境下，提供标准的饮食。将70只新西兰兔按不同的肠系膜缺血时间(0、15、30、45、60 min)分为A、B、C、D、E共5组，每组14只。

　　1.1.2 主要试剂及仪器

　　丙二醛(MDA)测定试剂盒、蛋白定量(双缩脲法)试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。主要仪器:752型紫外线分光光度计(Beckman Coulter, Ltd)，可调到95 ℃左右的恒温水浴箱(上海医用分析仪器厂)，台式高速冷冻离心机，XW80A型旋涡混合器(上海医用仪器厂)，组织切片机，组织贴片机，组织包埋机，生物显微镜。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备

　　所有新西兰兔术前12 h禁食，自由进水。100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉。以4号头皮针自兔耳缘静脉补充50 g/L葡萄糖氯化钠注射液(50 mL/kg)。上腹正中切口，长约10 cm,进腹后于肠系膜根部仔细分离显露肠系膜上动脉，用无创小血管夹阻断，按组别不同，依次阻断不同的时间，A组只分离解剖出肠系膜上动脉，不予阻断，其余各组达到阻断时间要求后移去阻断钳充分再灌注2 h。各组均在手术开始后70 mim内关闭切口。

　　1.2.2 标本采集及指标观察

　　每组取8只于再灌注2 h后沿原切口入腹，直视下行下腔静脉穿刺取血5 mL，在无菌原则下取距回盲部约20 cm的近端小肠组织5 cm左右。血标本收集后，常温下静置30 min, 3 000 r/min离心15 min,分离的血清保存于-20 ℃冰箱，待所有标本收集完后一次性检测。采用MDA测定试剂盒检测血清中MDA含量的变化。肠组织用40 g/L甲醛溶液固定，用石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，光镜下观察小肠组织形态学变化，并采用双盲法按CHIU等[3]的 6级评分法对小肠黏膜损伤程度进行评分。另6只兔用于术后24、48、72 h生存率的观察。

　　1.2.3 统计学方法

　　采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析和多组间均数比较的LSDt检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组术后生存率比较

　　A、B、C组动物术后24、48、72 h的生存率均>83.3%。D、E两组术后生存率与A组比较差异均有显著性(u=2.00～2.42,P<0.05)。见表1。表1 各组术后生存率比较(略)

　　2.2 各组血浆中MDA含量及小肠病理检查结果比较

　　C、D、E组的MDA含量及肠黏膜损伤评分与A组比较，差异均有显著性(F=12.13、280.24,P<0.01)。见表2。表2 各组兔血浆MDA含量及小肠组织病理检查评分比较(略)

　　3 讨 论

　　本研究对不同肠系膜上动脉阻断时间的造模过程中，均显示较高的手术成功率。因此,应用夹闭肠系膜上动脉方法制备急性肠道IRI模型的造模成功率高。周密的术前准备,熟练而有经验的手术操作者,术中各人员的相互配合、各司其职以及术后对动物的细心护理是保证较高手术成功率的关键[4]。本文结果显示，C、D、E组血浆MDA水平均较A组显著升高,从功能学角度说明夹闭肠系膜上动脉30～60 min再灌注2 h可制备急性肠道IRI模型。另外,从术后动物小肠外观的对比以及肠组织学改变和病理评分结果,进一步从形态学角度说明我们制备了可靠的肠道IRI模型。

　　肠道IRI一直是国内外医学界研究的热点之一[5]。既往对肠道IRI的研究,大多以SD大鼠为研究模型，但SD大鼠肠系膜上动脉细，手术过程中不易寻找分离，而新西兰兔体积大，肠系膜上动脉较粗，手术中易于寻找分离，且新西兰兔性情温和，更利于麻醉及术后护理的进行。

　　肠道IRI不仅仅表现在肠管本身，而且由于肠道与其他脏器不同之处——肠道内菌群的存在[6],在肠道IRI发生后，由于炎性因子的释放、肠黏膜屏障的破坏、细菌易位等对全身多器官都有很大的损伤[7]，这可能是D、E两组术后长期生存率低的主要原因。研究表明，肠道IRI后，除肠道本身外，心脏、肺脏、肝脏、肾脏等重要脏器皆会出现不同程度的次级损伤[8]。国内范华等[9]的研究表明，成年猕猴肠道IRI后，回肠内细菌数量增加约106倍，回肠组织中胃肠多肽等明显增加，而生长抑素和血管活性肠肽的浓度却明显降低,这可能为小肠动力下降的启动因素。有研究同样证明了在肠道IRI后，肠道、肝脏、肺脏等全身组织中的P选择素表达明显上调，髓过氧化物酶及血清丙氨酸转氨酶等都明显升高，提示全身组织损伤的存在[10]。

　　综上所述，应用阻断兔肠系膜上动脉30 mim再灌注2 h的方法, 既能够保证肠道功能严重损伤，又能保证远期生存率>80%，从而制备可靠的急性肠道IRI模型。

　　【参考文献】

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　　[7]CARLOS HENRIQUE MARQUES DOS SANTOS, OTONI MOREIRA GOMES, JOSE CARLOS DORSA VIEIRA PONTES, et al.The ischemic preconditioning and postconditiong effect on the intestinal mucosa of rats undergoing mesenteric ischemia/reperfusion procedure[J]. Acta Ciruurgica Brasileira, 2008,23(1):2228.

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　　[9]范华,谭庆华,需兰涛,等. 肠缺血再灌注时肠道菌群变化及胃肠多肽的作用[J]. 中华消化杂志, 2007,27(2):99102.

　　[10]纪阳,蔡尚郎,徐传金. RISK信号转导通路对肠系膜上动脉缺血后处理的心肌保护作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(2):129132.