一种羊腰椎间盘退变模型的建立

　　作者：胡鹏 作者单位：青岛大学医学院附属医院骨科研究室暨山东省创伤研究所，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 建立一种腰椎间盘缓慢退变的羊动物模型。方法 取16只山羊随机分成A、B、C、D共4组(每组4只)，前3组分别采用不同直径穿刺针(16 G、18 G、27 G)针刺的方法损伤腰椎间盘左前外侧纤维环，D组仅暴露椎间盘未损伤。分别于术前及术后3、6、12、24周对山羊腰椎间盘行放射学和组织学观察。结果 C、D组椎间盘无明显改变;A、B组观察到缓慢、可靠的椎间盘退行性变化。结论 本方法可以建立一种较理想的椎间盘缓慢退变的羊动物模型。

　　【关键词】 椎间盘 退变 放射学 组织学 羊

　　ESTABLISHMENT OF AN INTERVERTEBRAL DISC DEGENERATION MODEL IN GOAT HU PENG, LIU YONG, HU YOUGU, et al(Department of Orthopaedics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo establish an intervertebral disc degenerative model in goat. MethodsSixteen goats were evenly divided into four groups in random. In groups A, B, and C, puncture needles with 16 G, 18 G, or 27 G were used to induce injuries to the left anterolateral anulus fibrosus of the experimental animals respectively. In group D, the dics were exposed operatively but not injured. Radiological examination and histological study were performed both before and 3, 6, 12 and 24 weeks after the experiment. ResultsNo significant changes were found in groups C and D. Slow and progressive intervertebral disc degeneration was found in groups A and B. ConclusionA relatively ideal goat slowmoving intervertebral disc degenerative model can be made by the method used in this study.

　　[KEY WORDS]intervertebral disc; degeneration; radiology; histology; goats

　　腰背痛和腰椎间盘突出症的准确病因目前仍有很大争议，但椎间盘退行性变被一致认为在其发生、发展中发挥重要作用[1]。动物模型可以模拟人类椎间盘退行性变的过程，用于其病因、药理学或生物治疗的研究。本实验经过放射学、组织学观察，旨在获得一种缓慢、可靠的椎间盘退行性变动物模型。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　选取健康成年山羊16只(青岛大学医学院附属医院动物实验室提供)，雌雄各8只，(10.5±0.5)月龄，平均体质量为(31.3±5.6)kg。随机分为A、B、C、D共4组，每组4只。在标准饲养条件下适应性饲养2周。

　　1.2 动物模型建立及观察方法

　　①术前禁饮食36～48 h，术前20～30 min肌注阿托品0.03～0.05 mg/kg。②分别在羊臀部肌注氯胺酮10 mg/kg及地西泮10 mg。③取山羊前肢内侧浅静脉建立静脉输液通道，氯胺酮1～2 mg/kg静脉缓慢推注给药。④行气管插管术。⑤山羊取右侧卧位，头部略低于躯干，以羊最末一节肋骨下缘、髂嵴上缘、腰椎横突下4 cm、腰椎横突为边界的矩形区域剃毛备皮、消毒，以腰椎横突下2 cm的纵线(肋骨下缘、髂嵴上缘之间长约10 cm)为切口位置。20 g/L利多卡因5 mL局麻后经腹膜后入路暴露腰椎间盘，动作要温柔、仔细，避免损伤椎体周围的韧带和组织，任意选相连的4个椎间盘，穿刺针(特制金属箍控制刺入深度)在其纤维环的左前外侧刺入10 mm深达髓核(纤维环平均厚度为7.5 mm[2])并停留5 s，在相应椎体的横突用金属线作标记。其余椎间盘未损伤作对照，逐层缝合。术中根据麻醉的深浅可适当追加氯胺酮1～2 mg/kg，地西泮0.1～0.3 mg/kg。⑥待动物较清醒、活泼后，拔出气管插管并肌注地塞米松5 mg。⑦动物术前及术后3 d肌注青霉素160万单位，术后室内休养3 d。⑧A组用16 G针、B组用18 G针、C组用27 G针穿刺，D组只暴露椎间盘未穿刺。⑨各组动物采用上述的方法全麻后分别于术前1周及术后3、6、12、24周，摄腰椎正、侧位X线片。⑩术后各个时间点影像学检查后，每组各处死1只山羊(静脉内注射过量苯巴比妥钠),每次处死山羊可收获到12个针刺过的椎间盘，12个未损伤的椎间盘(D组6个，A、B、C组各2个)。共得到针刺与未损伤椎间盘各48个。立即用40 g/L甲醛液固定1周，乙二胺四乙酸(EDTA)做脱钙处理，石蜡包埋，切成6 μm厚的切片。番红O和苏木精伊红染色后光学显微镜下观察。

　　2 结 果

　　2.1 X线观察

　　D组术后各阶段腰椎生理弯曲无改变，椎体间隙无变窄及骨赘形成，椎体上下终板未出现钙化。A组3周后观察到部分术后椎间隙与术前比变窄;6周后观察到早期骨赘形成、部分椎间隙进一步变窄，12周后观察到骨赘体积增大、数量增多，椎间隙变窄程度加重，部分终板肥厚钙化;24周椎间盘退行性变进一步加重、部分骨赘连接成骨桥。B组比A组退变略轻、略慢，且12～24周这段时间内退变进展缓慢。C组未观察到明显变化。

　　2.2 组织学观察

　　D组椎间盘的纤维环由胶原构成的板层样结构组成，呈后侧U形、前侧稍前突的纤维环板层模式，环中任何部位均未出现断裂纤维和S形撕裂，髓核由大量的较大的、空泡状的脊索细胞和较小的软骨样细胞构成。3、6、12、24周均未观察到明显变化。A组3周后髓核表现为脊索细胞减少而软骨样细胞增多;6周后脊索细胞数目进一步降低，软骨样细胞数目也开始降低，纤维环折叠、结构破坏伴随软骨骨赘形成;12周后大部分刺伤节段出现软骨骨化骨赘，髓核内脊索细胞消失，并逐渐被絮乱的、细胞减少的纤维样组织替代;24周髓核大部分已纤维化，纤维环断裂现象已十分明显，基本无法辨认纤维环、髓核边界，软骨样骨赘广泛形成。B组比A组退变略轻、略慢。C组未观察到明显变化。

　　3 讨 论

　　本实验的目的是建立一种可模拟人椎间盘缓慢退变的可靠模型，以研究其发病机制和安全有效的治疗方法。椎间盘退行性变动物模型分为自发性和诱导性两大类，各有优缺点，前者需要的动物样本量巨大难以普及应用。

　　理想的腰椎间盘退变动物模型具有以下特点:能再现椎间盘退行性病变的客观规律;模型重复性好;所选动物解剖和生理特点尽可能与人类近似[3]。动物大小与椎间盘的生物力学特性密切相关，小动物椎间盘小，重力负荷小，需要的营养少，损伤后易修复，对人类椎间盘退变的模拟度低;但对经济条件要求低且易于操作。大动物模型对人类椎间盘退变模拟程度高;但对经济条件、麻醉技术、手术技巧、动物实验室条件等要求高。尤其是灵长类，在生物进化方面同人类的亲缘关系密切，且其腰椎间盘与人类在生物化学、机械力学特性方面类似，是用于制作椎间盘退变模型理想的动物。但因经济、法律因素其应用受到一定限制[3]。本实验采用羊作为实验动物。前瞻性研究资料“思考用羊作为人脊柱的动物模型”提供的研究报告表明，羊和人类的腰椎在大体解剖上相似[4]。这两个物种的椎体、椎间盘形状、髓核相似;腰椎椎间盘纤维环的水分含量、胶原含量和胶原纤维的取向角度均相似。REID等[5]研究显示，羊和人的脊柱在生物力学和生物化学方面具有相似性。已经用羊腰椎椎间盘进行了评价椎间盘置换和移除效果等方面的实验研究。

　　经典的刺伤模型是用11号刀片切开成年兔腰椎椎间盘前侧纤维环的全层，以产生与人腰椎椎间盘退行性变类似的生物化学和组织学变化。可这种髓核迅速突出的全层切开动物模型既不适用于研究髓核和纤维环的渐进性变化，又不适用于检验仅作用于椎间盘早期退变的新式治疗方法。本实验采用穿刺损伤山羊前外侧纤维环的方法以获得较缓慢的椎间盘退变动物模型，穿刺针的直径和刺入深度可以控制。此方法创伤小、效果可靠、可重复性强。放射学和组织学结果显示，A组、B组均得到了缓慢、可靠的椎间盘退行性变动物模型。C组未观察到明显退变，提示用27 G针穿刺纤维环不引起椎间盘退行性变。因此，推测在检验生长因子、质粒、药物试剂、组织工程[6]等新式椎间盘退变治疗方法时，可用27 G或更细的针进行穿刺向椎间盘组织内注射。目前的治疗主要局限于缓解症状而不是椎间盘结构完整性的修复。理想的治疗方法是针对椎间盘退变的原因，通过人工干预，在早期阻止或逆转椎间盘退变的发生发展，恢复其生物学功能，即椎间盘退变的生物学治疗。

　　总之，通过针刺损伤山羊纤维环的方法，可以获得一种可靠的椎间盘缓慢退行性变的动物模型。

　　【参考文献】

　　[1]NORCROSS J P, LESTER G E, WEINHOLD P, et al. An in vivo model of degenerative disease [J]. J Orthop Res, 2003,21(1):183188.

　　[2]OSTI O L,VERNONROBERTS B, FRASER R D. Anulus tears and intervertebral disc degeneration: an experimental study using an animal model[J]. Spine, 1990,15(8):762767.

　　[3]西永明，胡有谷. 椎间盘退变模型的建立及其历史和现状[J]. 中华骨科杂志， 2000，20(6):378379.

　　[4]WILKE H J, KETTLER A, WENGER K H, et al. Anatomy of the sheep spine and its comparison to the human spine[J]. Anat Rec, 1997, 247(4): 542555.

　　[5]REID J E, MEAKIN J R, ROBINS S P, et al. Sheep lumbar intervertebral discs as models for human discs[J]. Clin Biomech, 2002,17(4):312314.

　　[6]宁斌，胡有谷，刘勇，等. 成人退变椎间盘细胞微载体培养的形态学观察[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(3):205206.