载万古霉素缓释钢板对兔胫骨金黄色葡萄球菌感染模型预防作用的研究
发表时间：2010-04-16 浏览次数：604次
作者：费军，赵玉峰，余洪俊，潘长江，唐良华，王爱民 作者单位：1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心，重庆400042;2.第三军医大学 西南医院康复科，重庆400038;3.重庆大学生物工程学院，重庆400044
【摘要】 目的探讨载万古霉素缓释钢板在兔胫骨金黄色葡萄球菌感染模型中的预防作用。方法新西兰白兔64只，制备胫骨中段单侧皮质横断骨折模型，分别置入载万古霉素缓释钢板和普通不锈钢钢板，注射金黄色葡萄球菌，比较两种钢板对兔胫骨金葡菌感染模型的预防作用。结果64只兔共存活48只，置入载万古霉素缓释钢板的实验组兔24只中感染2只，普通钢板对照组24只中感染14只，两组之间差异有统计学意义(P=0.001，P<0.05)。两组之间白细胞总数、血沉、C反应蛋白差异有统计学意义(P<0.05)。结论载万古霉素缓释钢板在兔胫骨金黄色葡萄球菌感染模型中有较明确的预防作用。
【关键词】 万古霉素;钢板;细菌感染;模型;胫骨
Prevention study on the staphylococcus aureus infection of rabbit tibia fracture model by plate of vancomycin
FEI Jun,ZHAO Yufeng,YU Hongjun,et al.
Trauma Center,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing400042,China
Abstract：ObjectiveTo study the prevention effect on the staphylococcus aureus infection of rabbit tibia fracture model by plate of vancomycin.MethodsSixtyfour white New Zealand rabbits were used to make the model of the midshaft of tibia fracture,and implanted into it with the vanlomycin plate and the common stainless plate respectively and staphylococcus aureus was inoculated.The preventive effect on the staphylococcus aureus infection of rabbit tibia fracture model between the two type plates was compared.ResultsThere were 48 alive in the 64 rabbits infection was confirmed in 14 rabbits out of 19 common plates fixation model,while 2 of 29 rabbits treated with plate of vancomycin got infected.The difference of total white blood cell count,sedimentationra and Creactive protein between the two groups had statistical significance.ConclusionThe plate of vancomycin has definite preventive effect on the staphylococcus aureus infection of rabbit tibia fracture model.
Key words:vancomycin;plate;infection;model;tibia
据国际内固定研究协会AO组织2006年报道，开放性骨折中感染率为3%～40%[1]，如使用内固定则感染率增加>30%。资料同时显示：每年在美国约有200万例院内感染病例，约50%与内植物有关[2]，不仅消耗高达110亿美元的巨大社会财富,还导致包括细菌耐药、截肢甚至死亡等严重后果[1]。因此，开放性骨折禁忌进行钢板等内固定术，而建议使用外固定支架。由于外固定具有针道感染率高达100%[2]、钢针松动、不便于早期功能锻炼等缺点，近年来，在彻底清创的基础上，已有人开始在开放性骨折中尝试使用内固定[3]，但争议很大。为此，我科联合重庆大学生物工程学院研制出了“载万古霉素缓释钢板”，以兔胫骨金黄色葡萄球菌感染模型进行了动物实验，现报道如下。
材料与方法
1材料
聚消旋乳酸(PDLLA)由重庆大学生物工程学院提供，Mv=5.8万，盐酸万古霉素(40万单位/支)，由华北制药集团提供，乙酸乙酯和丙酮由成都金山试剂公司提供。
2涂层溶液的配制
涂层溶液的配制是制备良好药物涂层的先决条件，一般来说，要制备光滑均匀的药物涂层，涂层溶液必须均匀并且所采用的溶剂容易挥发，这样才能获得均匀的薄膜。由于PDLLA是一种脂溶性的高分子，不溶解于有机溶剂，而盐酸万古霉素是一种几乎只能溶解于水的抗生物，因此很难使盐酸万古霉素与PLA材料在同一种有机溶剂中溶解。本研究经过大量试验获得一种三元溶剂组合，其配方为：乙酸乙酯：丙酮：水=15：5：1(v/v)。操作过程：按比例量取15ml的乙酸乙酯溶液，加入称量好的聚乳酸(2g)，充分溶解后加入5ml的丙酮溶液，最后加入1ml含有盐酸万古霉素(222mg)的水溶液，在磁力搅拌器上充分搅拌直至形成透明的溶液。
3药物涂层的制备
将抛光的316L不锈钢骨内固定板依次用丙酮、乙醇、蒸馏水进行10分钟的超声清洗，然后在真空干燥箱充分干燥。把干燥后的不锈钢材料放入活化液中(H2SO4+H2O2)10分钟后取出用蒸馏水充分清洗后干燥，最后将不锈钢浸没入配制好的涂层溶液中，浸没一段时间后取出在室温下让溶剂充分挥发自然成膜，最后在真空干燥箱中常温干燥72小时，取出备用(图1)。
4实验动物及模型制作
采用我院动物所提供新西兰健康大白兔64只，制作感染性骨折模型[4]：全麻下显露右侧胫骨中段，线锯制造横断骨折，保留单侧皮质不离断，骨折端置注射针头，闭合切口后注射1×105金黄色葡萄球菌悬液(ATCC 25923)0.1ml或直至切口有细菌悬液溢出。
5标本采集和资料收集方法
载万古霉素缓释钢板实验组和普通不锈钢钢板对照组各32只，每日测量兔体温、体重，连续动态观察。分别于术后第1、3、7、14、28周留取血液标本，进行血常规、血沉、C反应蛋白检测。于第7天、第14天、第28天摄X 线片，并处死兔取材行20%EDTA脱钙，常规HE染色观察局部组织学变化。
6骨感染诊断标准[5]
以病理、细菌培养来确定是否为感染(具备以下特征中的两条为骨感染)：(1)X线片显示有骨破坏、骨赘形成、软组织脓肿影;(2)组织切片发现脓肿、坏死骨、骨膜下新骨形成、多核巨细胞浸润等;(3)细菌培养出金黄色葡萄球菌。
7统计学数据处理
采用SPSS软件10.0版本。行等级资料检验、χ2检验、Spearman相关分析，显著性检验标准为P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
结果
164只兔中存活48只，其中载万古霉素缓释钢板实验组存活24只，该组确认为感染的有2只，普通不锈钢钢板对照组存活24只，确定感染的为14只，经检验χ2=13.500，P=0.001,P<0.05，两组之间差异有统计学意义。
2体温及体重情况比较研究：术后第1周所有兔的体重均轻度下降，其后体重逐渐增加，平均体重自术后第1天的(3.13±0.18)kg增加到处死时的(3.61±0.25)kg，t=0.817，P=0.419，P>0.05，两组之间无统计学差异。所有兔的体温在实验阶段均保持稳定，两组之间无统计学差异。
3两组之间白细胞、血沉、C反应蛋白比较研究
(见表1、2)。表1载万古霉素钢板与普通不锈钢钢板白细胞(109/L)和血沉(mm/h)比较(略)表2载万古霉素钢板与普通不锈钢钢板C反应蛋白(mg/L)比较(略)
讨论
1固定物相关感染的现状和局部应用抗生素的进展
据AO组织报道，目前在使用内固定的人群中约5%发生了感染，平均每例感染的治疗费用在15000美元[1]。在固定物相关感染发生率高、抗生素耐药菌株日益增加和系统性全身应用抗生素局限性逐渐被认识的背景下，局部预防性或治疗性应用抗生素已成为在固定物相关感染的治疗中具有前景的主要措施之一，尤其是把固定物与抗生素组合或者合成在一起的途径。这种设想把固定物本身变成了“抗生素释放系统”[6]，其好处为在植入固定物的同时获得了额外的局部释放抗生素的益处，使局部聚集了高浓度的抗生素而很少有全身性的副作用，特别是在如髓内针固定术等闭合性复位的手术中更有利于患者的治疗;同时，通过生物降解材料可以把抗生素物质限定在一定的时间段内释放以产生合理的药效学，最大程度地减少了对耐药菌株筛选的风险。因此，含有抗生素的骨科器械已被看作是骨科器械发展的“未来”。目前在临床上多采用缓释载体载抗生素以期在局部保持较长时间的局部高浓度抗生素。其基本理念为：抗生素在特定的部位逐步地释放抗生素，以获得较全身性使用抗生素更高的浓度。其中，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)是最早被用于骨科领域的生物材料之一，形成的产品有PMMA抗生素骨水泥、庆大霉素PMMA链珠，还有以胶原为载体的庆大霉素胶原膜和载抗生素涂层的固定物等[7]。但是，这些产品在不同程度上存在着在最初释放出高浓度的庆大霉素以后，会长期在固定物周围产生低浓度的庆大霉素，从而诱导耐药菌株产生的缺陷。
2载万古霉素钢板的抗感染性能及万古霉素的体内释放特点
鉴于前述的固定物相关感染，本研究在国外载抗生素涂层固定物的启发下，研制出了载万古霉素钢板。在研制过程中，我们认识到就局部万古霉素释放系统而言，应该达到以下基本要求：缓释技术必须保证快速释放超过最低抑菌浓度(MIC)浓度水平的万古霉素;药物释放必须在一定的时间内，避免产生耐药性菌株;杀菌性抗生素应该产生杀菌效应，而不是仅仅抑菌;药物缓释系统应该自行降解，而且有利于阻止细菌黏附在固定物表面。因此，我们选择了PDLLA作为载体，制作成缓释涂层。万古霉素对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的最小抑菌浓度和杀菌浓度分别是1.2mg/L和2.1mg/L，药物敏感的折点值为5mg/L。因此，以敏感的折点值作为标准，从体外万古霉素的释放来看，据我们测试直到第14天，仍然保持着约(29.77±4.48)mg/L的释放浓度，显然高于前面所提到的药物敏感的折点值。
本研究从动物实验的结果来看：载万古霉素钢板组兔的感染率与普通钢板组兔的感染率有显著差异。两组之间白细胞自术后第1~14天均有显著性差异，血沉和C反应蛋白分别自术后第3~14天和术后第1~7天有显著性差异。这些结果说明了载万古霉素钢板在兔体内能够释放出高于药物敏感的折点值的有效浓度。同时，由于血沉对感染的反应较CRP为迟，因此，能够表现出第3~14天的感染状态，而CRP虽然较为敏感，但只是在感染的早期阶段在兔血液中升高，后期并未体现出感染状态。可能与本实验的样本量不足或与血沉能够反映时间较长的感染状态，而CRP更有利于反映急性感染状态有关。
应该认识到，彻底而完整的清创并不能够被载万古霉素缓释钢板所取代，在开放性骨折或骨髓炎的治疗中仍然需要按照现有的外科原则进行处理。但是，载万古霉素钢板的万古霉素的释放特点使传统的全身或局部使用抗生素的途径和方法产生了根本性的改变，自内而外的释放，为临床中开放性骨折的治疗提供了一条新的解决途径。
【参考文献】
[1]Harris LG,Richards RG.Staphylococci and implant surfaces: a review[J].Injury,2006,37(2):S3-14.
[2]Gollwitzer H,Ibrahim K,Meyer H,et al.Antibacterial poly(D,Llactic acid) coating of medical implants using a biodegradable drug delivery technology[J].J Antimicrobial Chemother,2003,51(3):585-591.
[3]Bagno A,Genovese M,Luchini A,et al.Contact prolometry and correspondence analysis to correlate surface properties and cell adhesion in vitro of uncoated and coated Ti and Ti6Al4V disks[J].Biomaterials,2004,25(12):2437-2445.
[4]Arens S,Schlegel U,Printzen G,et al.Influence of material for fixation implants on local infection[J].J Bone Joint Surg(Br),1996，78(4):647-651.
[5]Worlock P,Slack R,Harvey L,et al.An experimental model of posttraumatic osteomyelitis in rabbits[J].Brit J Exper Pathol,1988,69(2):235-244.
[6]Darouiche RO,Farmer J,Chaput C，et al.Antiinfective efficacy of antisepticcoated intramedullary nail[J].J Bone Joint Surg(Am),1998,80(9):1336-1340.
[7]Diefenbeck M,Mückley T,Hofmann GO.Prophylaxis and treatment of implantrelated infections by local application of antibiotics[J].Injury,2006,37(2)：S95-104.
