改构型aFGF减轻大鼠小肠缺血再灌注所致肠道细胞凋亡

    作者：赵京禹，付小兵，陈 伟，郑曙云，孙同柱    （解放军总医院304临床部全军创伤修复重点实验室，北京 100037）     摘要: 目的   研究改构型酸性成纤维细胞生长因子（maFGF）对大鼠肠缺血再灌注损伤所致肠道细胞  凋亡的影响。  方法   将54只大鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组和maFGF治疗组。假手术组大鼠暴  露肠系膜上动脉（SMA），不夹闭。生理盐水对照组和maFGF治疗组大鼠以SMA夹闭造成肠缺血45分钟，  松夹形成缺血再灌注，于再灌注即刻分别静脉注射生理盐水0.1ml和maFGF 4μg，缺血再灌注2、6、12、24小  时，取小肠组织观察组织学改变，用末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术  （TUNEL）检测肠道细胞凋亡率。  结果   组织学检查显示生理盐水对照组缺血再灌注2～24小时肠道损伤  严重，maFGF治疗组肠道损伤较生理盐水对照组有所减轻。细胞凋亡检测结果假手术组肠道细胞凋亡率很  低，生理盐水对照组和maFGF治疗组细胞凋亡率明显高于假手术组。缺血再灌注12小时，生理盐水对照组  细胞凋亡率高达（62.8±1.7）%，而maFGF治疗组为（42.5±2.6）%，两者有统计学差异（ P <0.05）。  结论     maFGF能减轻大鼠肠缺血再灌注所致的肠道细胞凋亡。

    关键词:  酸性成纤维细胞生长因子; 缺血再灌注; 小肠; 细胞凋亡

    Effects of modified acidic fibroblast growth factor on apoptosis in intestinal tissue   after ischemia and reperfusion in rats    ZHAO Jing-yu，FU Xiao-bing，CHEN Wei，et al.   （Key Research Laboratory of Wound Repair，304th Clinical Department of PLA General Hospital，Beijing 100037，China）   Abstract: Objective  To investigate the effect of modified acidic fibroblast growth factor （maFGF） on the   apoptosis in intestinal tissue after ischemia-reperfusion（I/R） injury in rats. Methods  Fifty-four Wistar rats were   divided randomly into 3 groups: sham-operated group，saline treatment group and maFGF treatment group. In sham-  operated group，superior mesenteric artery（SMA） was separated without occlusion. In saline treatment and maFGF   treatment groups，the rats sustained 45 minutes of SMA occlusion followed by reperfusion，and were injected with sa-  line（0.1 ml/rat） and maFGF（4 μg/rat） respectively. Intestinal tissues were collected at 2，6，12 and 24 hours af-  ter reperfusion to evaluate histological changes and to detect apoptosis with terminal deoxynucleotide transferase me-  diated dUTP-biotin nick end labeling（TUNEL） method. Results  The changes in histological structure indicated   that the intestinal tissue was damaged after intestinal I/R injury in saline treatment group. In maFGF-treated rats，  the damage was restricted. The apoptotic signal in sham-operated group was weak，while the apoptotic rates in saline   treatment and maFGF treatment groups were elevated. After reperfusion for 12h，the apoptotic rates were （62.8±1.  7）% in saline treatment group，which was significantly higher than that of maFGF treatment group（42.5±2.6）%.   Conclusion  maFGF could alleviate apoptosis induced by ischemia and reperfusion in rat intestinal tissues.  

    Key words: acidic fibroblast growth factor; ischemia-reperfusion; small intestine; apoptosis

    细胞凋亡作为细胞死亡的一种形式正在逐步引  起人们的关注，已有研究表明生长因子可以减轻肠   缺血再灌注损伤造成的组织坏死和细胞凋亡    ［1，2］   。  由于生长因子的促分裂活性与细胞增殖、分化以及  肿瘤的发生可能存在一定的联系，因而其大规模应  用受到一定限制。为此，人们通过基因工程技术，将  某些生长因子进行改构，产生一种突变体生长因子，  称之为改构型生长因子。笔者以前的实验研究结果  提示应用改构型酸性成纤维细胞生长因子（modified   acidic fibroblast growth factor，maFGF）对大鼠肠缺血再灌注损伤后肝、肾功能有一定的保护作用。本实  验以maFGF应用于大鼠肠缺血再灌注损伤模型，观  察maFGF对大鼠肠缺血再灌注损伤所致肠道细胞  凋亡的影响，从另一个角度研究maFGF对大鼠肠缺  血再灌注所致肠道损伤的保护作用。   

    材料与方法  

    1  动物模型  

    Wistar大鼠54只，雄性，体重230～250g。将大  鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组和maFGF治  疗组，后2组再各自分为缺血再灌注2、6、12和24小  时4组，每组6只大鼠。生理盐水对照组和maFGF治  疗组大鼠经股部肌肉注射速眠新注射液0.15ml麻醉  后，按无菌操作开腹，钝性分离肠系膜上动脉（SMA），  用无创血管夹夹闭SMA根部阻断血流45分钟，松夹，  恢复肠道血流形成缺血再灌注损伤模型    ［2］    。假手术  组大鼠只分离SMA，不夹闭，维持45分钟。  

    2  maFGF的应用   生理盐水对照组和maFGF治疗组大鼠于缺血  再灌注形成即刻，从大鼠阴茎背静脉注射生理盐水  0.1ml或maFGF 0.1ml（40μg/ml，maFGF由暨南大  学医药生物技术研究开发中心研制）    ［3］    ，关腹，皮下  注射生理盐水10ml进行复苏。  

    3  标本采集   假手术组大鼠分离SMA 45分钟，生理盐水对照  组和maFGF治疗组大鼠于缺血再灌注2、6、12和24  小时，采集标本。在距离回盲部10cm处，取小肠组  织置10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，进行组织  学检查和细胞凋亡检测。   4  组织学检查   小肠组织切片进行苏木精-伊红（HE）染色，以  观察组织学改变。   5  细胞凋亡检测   细胞凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司，实  验操作按说明书进行。切片（5μm）脱蜡至水，加蛋  白酶K在37℃条件下孵育30分钟，PBS冲洗2次，  切片浸泡含30%BSA和20%正常胎牛血清的Tris-  Hcl液30分钟，PBS冲洗2次，加50μl末端脱氧核   糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术  （TUNEL）反应液37℃暗室湿盒孵育60分钟。PBS  冲洗3次，加50μl过氧化物酶转换液37℃湿盒孵育  30分钟，PBS冲洗3次，最后加显色底物二氨基联苯  胺（DAB）显色，PBS冲洗3次，苏木素复染，脱水封  片，以胞核呈棕色者为阳性染色。镜下观察细胞凋  亡在组织中的定位，每张切片选择有代表性的视野，  计数细胞凋亡百分率。   6  统计学处理   细胞凋亡百分率每个数据（p）经“反正弦函数  转换”（x'=arc sin   p ）后，作方差分析。文中结果以  百分率均数±标准差（ ˉ x±s ）表示。   

    结 果   

    1  组织学观察   假手术组小肠呈现正常的小肠组织结构。生理  盐水对照组和maFGF治疗组缺血再灌注2～24小  时小肠损伤均较重，比较而言，生理盐水对照组小肠  损伤更重，表现为肠黏膜水肿、脱落，黏膜下层炎细  胞浸润，肠绒毛结构消失。maFGF治疗组损伤较轻，  主要变化为肠黏膜充血、水肿，黏膜下层少量炎细胞  浸润，部分肠绒毛结构尚存。   2  细胞凋亡定位   假手术组细胞凋亡仅发生在肠绒毛顶端的上皮  细胞。生理盐水治疗组和maFGF治疗组发生在小  肠组织的全层，包括黏膜层的上皮细胞和固有层的  淋巴细胞、浆细胞，黏膜下层的血管和淋巴管以及肌  层的平滑肌细胞和浆膜层。   3  细胞凋亡率   假手术组细胞凋亡率很低。生理盐水对照组和  maFGF治疗组缺血再灌注2～24小时细胞凋亡率明  显增高，均显著高于假手术组（ P <0.05）。生理盐  水对照组缺血再灌注12小时细胞凋亡率高达（62.8  +1.7）%，而maFGF治疗组为（42.5±2.6）%（ P <    0.05） 。其余时相点，maFGF组凋亡细胞率也略低  于生理盐水对照组，但无统计学意义（见表1及图1  ～3）。    肠道细胞凋亡变化 （TUNEL ×100）    图3  maFGF治疗组缺血再灌注12小时肠  道细胞凋亡变化 （TUNEL ×100）

    讨 论  

    以往研究表明酸性成纤维细胞生长因子（αFGF）  具有多种生物学功能。αFGF对多种组织有较强的促  有丝分裂活性，能够促进创面肉芽组织生长、诱导毛  细血管胚芽形成与再上皮化，对创面修复有明显的促  进作用    ［3，4］    。αFGF也能作用于缺血性脏器，对肾急  性缺血与再灌注损伤的有治疗作用    ［5］    。这些研究成  果反映出了生长因子的广阔临床应用前景。   由于野生型αFGF的促分裂活性与细胞增殖、  分化以及肿瘤的发生可能存在一定的联系，因而在  大规模应用时受到一定限制。为此人们通过基因工  程技术，将野生型αFGF进行改构，删去核转位区后  αFGF诱导DNA合成和细胞增殖能力丧失，但仍能  与αFGF受体结合并诱导受体介导的酪氨酸磷酸化  和C-fos的表达，产生一种突变体αFGF，称之为改  构型酸性成纤维细胞生长因子（maFGF）。该maF-  GF失去了促分裂效应，但仍保留非促分裂激素样活  性。在本研究中我们进一步研究外源性maFGF对  缺血再灌注后肠道细胞凋亡的影响。   细胞凋亡是机体自身的一种病理生理现象存在  于机体生长发育的各个阶段，对组织细胞的生理功  能产生着重要影响。细胞凋亡本身也受创伤以及其  他疾病因素的影响    ［5］    。组织变性坏死与细胞凋亡  共同构成了一些致伤因子和疾病导致机体损伤的某  些表现。   实验中，我们观察到maFGF能减少缺血再灌注  后肠道细胞的细胞凋亡，其中在缺血再灌注后的12  小时，maFGF组与生理盐水治疗组的凋亡细胞率之  间有统计学差异。maFGF减轻缺血再灌注后肠道  细胞的细胞凋亡机制可能为: （1） maFGF与其受体  的结合，激活了PI-3K和PKB，从而减轻了细胞凋  亡。有研究表明，整合素抑制细胞凋亡主要是通过   PI-3K和PKB途径实现的    ［6］    。而PI-3K和PKB上  游的ras蛋白可以由受体型酪氨酸蛋白激酶激活。  （2）   maFGF 能减轻缺血再灌注后肠道上皮细胞的损  伤。因为缺血再灌注作为一种致伤因素可以导致小  肠上皮细胞凋亡细胞的增多，因而减轻缺血再灌注  损伤程度的因素可能会减轻小肠上皮细胞凋亡细胞  的数目。maFGF有可能通过改善缺血再灌注后小  肠的血液循环，减轻小肠的损伤，因而导致小肠上皮  细胞凋亡细胞数目的减少。   本实验结果表明maFGF能减少肠缺血再灌注  后肠道细胞凋亡，maFGF在缺血再灌注损伤治疗中  可能具有一定的效果。  

    参考文献:   

    ［1］ 付小兵，蒋礼先，杨银辉，等.缺血-再灌注致肠道细胞凋  亡的特征及碱性成纤维细胞生长因子对其转归的影响  ［J］.中国危重病急救医学，1998，10（8）:455-4582.  

    ［2］ 屈纪富，郝利，孙薇，等.细胞因子在创伤愈合过程中的  变化及其意义的研究进展［J］.创伤外科杂志，2003，5  （1）:74-76. 

    ［3］ Mellin TH，Cashen DE，Ronan JJ，et al.Acidic fibroblast   growth factor accelerates dermal wound healing in diabetic   mice［J］.J Invest Dermatol，1995，104（5）:850-855.  

    ［4］ Pandit A，Ashar R，Feldman D，et al.Investigation of acidic   fibroblast growth factor delivered through a collagen scaffold   for the treatment of full-thickness skin defects in a rabbit   model［J］.Plast Reconstr Surg，1998，101（3）:766-775.  

    ［5］ Fu XB，Cuevas P，Gimebez-Gallego G，et al.Acidic fibro-  blast growth factor reduces renal morphologic and functional   indictors of injury caused by ischemia and reperfusion［J］.  Wound Rep Reg，1996，4（2）:297.  

    ［6］ 金伯泉.细胞和分子免疫学［M］.第2版.北京:科学出  版社，2001.643-645.