补体受体1型的结构功能及sCR1基因克隆表达的策略

    作者：罗 雪，汪正清     （第三军医大学基础部微生物教研室，重庆 400038）

    摘要:  补体受体1型（Complement receptor type1，CR1）具有外源性及内源性活性，既可灭活组装于非自身细胞膜上的C3.C5转化酶，也可灭活自身细胞膜上形成的C3.C5转化酶。CR1是唯一既对经典、替代及植物凝集素（MBL）3个补体激活途径的，对C3.C5转化酶拥有衰变加速活性，又有辅助1因子裂解C3b和C4b作用的补体调节蛋白。对补体分子的过度活化具有抑制和调节作用，在防治补体介导的缺血再灌注损伤以及异种器官移植超急性排斥反应等疾病中具有广阔的应用前景。本文主要综述CR1的结构功能及生物学活性，sCR1基因的克隆与表达及在创伤、缺血再灌注损伤中的应用研究现状。

    关键词: 补体;受体;生物学活性;基因;克隆

    Structure and function of CR1and proposal of cloning and high-level expression of sCR1

     LUO Xue，WANG Zheng-qing

    （Department of Microbiology，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

     Abstract: Complement receptor type1shows endogenous and exogenous activity，which can deactivate the C3.C5convertase on not-self and self cytomembrane.CR1has activation to the three pathways of complement activation to enhance decay of the C3.C5convertase and helps factor1to split C3b and C4b.Because of its inhibition and adjustment to over-acti-vation of complement，it has good future to be used in prevention and cure of ischemical reperfusion injury and xeno-organ transplantation.This article mainly overviewed the structure and function of CR1and proposal of cloning and high-level ex-    pression of sCR1including exploratory development current situation of ischemical reperfusion injury and trauma.

    Key words:complement;receptor;biological activation;gene clone

    补体受体1型（Complement receptor type1，CR1）是一种单链膜结合蛋白，与C3b和C4b有高度亲和性，CR1表达在许多类型的细胞表面，包括红细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及树突细胞等。CR1是内源性补体活性调节蛋白家族成员。可溶性补体一型受体1（Soluble complement receptor1，sCR1）是CR1的胞外片段，保留了抑制补体活化作用等功能单位，在治疗补体介导的缺血再灌注损伤以及异种器官移植超急性排斥反应等疾病中具有广阔的应用前景。

    1   补体受体1结构

    CR1即CD35，是一种细胞表面糖蛋白，分布于多种细胞表面，现已发现灵长类动物红细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞亚群、肾小球足突状细胞及囊状树突细胞表面均有CR1附着，还有少量CR1游离于血浆。提纯的CR1为分子量约200kD的糖蛋白，但后来发现它有4种分子量不同同种异型。研究表明，分子量的差异是由于基因不同所致。CR1有4种结构的等位基因型，其分子量和基因频率分别为:A190.000（0.83）;B220.000（0.16）;C160.000（0.01）;D250.000（<0.01），这种分子量的差异使它们对C3b调理过的免疫复合物（immune complex，IC）的结合能力不同［1］ 。CR1分子贯穿细胞膜，完整的CR1包含有2039个氨基酸残基，其中有41个氨基酸残基是信号肽，25个氨基酸残基是跨膜区域，43个氨基酸残基是细胞质部分，剩下的1930个氨基酸残基（大约有75%氨基酸序列）就是CR1的胞外区。最常见的一种CR1（220.000，CR1-A）的膜外部分由30个短同源重复序列（short consensus repeat，SCR）构成，每7个SCR为1组，构成4个长同源重复序列（Long homologous repeat，LHR）［2］ ，仅SCR29与30不是LHR的组成部分。每个SCR序列由60～70个氨基酸组成，且高度同源性［3］ ，并含有4个保存的半胱氨酸和40%的残基一致。每个SCR预测形成三叶草形状的二级结构。这种二级结构的构成应归因于两对半胱氨酸之间的分子间二硫键的形成［4］ 。每间隔8个短同源重复序列（SCR）有高度同源性，其同源性高达60%～100%，例如SCR-1、SCR-8和SCR-15;SCR-2、SCR-9和SCR-16等［5］ 。CR1基因定位于人第1对染色体长臂32区上，属于RCA（补体活性化调节剂）家族中的成员。经对CR1N端的cDNA分析表明，CR1多肽结构有3～5个连接的蛋白片段，它们的内部序列有高度的同源性为长同源重复序列（LHR）。每个CR1的LHR在数目上的同种异型变异性，说明不同个体的CR1在大小有很大差别。尽管LHR是CR1的独特标志，但其基本的SCR结构单元却在其他的C3.C4结合蛋白上可以找到，例如因子H、C4结合蛋白、衰变加速因子、CR2、因子B、C1r、C1s、C2和膜协同因子蛋白［6］ 。而且SCR也存在一些非补体蛋白中，如:IL-2-R、因子Ⅻb、β-2-糖蛋白。这证明SCR尽管有C3.C4的结合位点，但并不是一定有结合的活性［7］ 。相关实验证明LHR-A中有一个C4b的结合位点，LHR-B和LHR-C有C3b的结合位点。点突变研究进一步证实:C3b的结合残基在SCR8-11和15-18，C4b的在SCR1-4［8］ 。CR1由1条单一的多肽链组成，有25个Asn-x-Ser（Thr）序列基序，可形成N-连接的糖基化位点，估计含有6～8个N-连接复合低聚糖，没有O-连接糖类。在应用型研究中，科学家们更偏向于将CR1的跨膜与胞内部分去除形成可溶性的CR1（sCR1）。sCR1是CR1的胞外片段，保留了CR1抑制补体活性的结构和功能，即可抑制补体活化，及抑制补体介导的炎症损伤［9］ 。但实验发现sCR1在血中廓清很快，为延长半衰期可以将CR1的活性部位与半衰期长的免疫球蛋白（Ig）耦联制成嵌合体，该嵌合体内有8～11个SCR，有1个与C3b结合位点与1个F（ab）2，可与sCR1一样与C3b二聚体有效结合。免疫球蛋白（Ig）作为融合部分的另一个优势是具有针对特异组织的靶向补体抑制作用 ［10］ 。由于CR1是真核细胞蛋白，对于真核基因产物，科学家们着重关注于糖基化修饰与蛋白生物学活性之间的关系。糖基化的sCR1在电镜下呈边长为11.6nm的正方形，而未糖基化的sCR1则呈直径为8.2nm中心凹陷的园盘状。而且，未糖基化的sCR1会进一步聚合，变成直径为19.0nm的圆盘状低聚物。这样会使蛋白更容易以可溶的形式存在于溶液中。去糖基化的sCR1分子量为200KD，比糖基化的sCR1少20KD左右。去糖基化的sCR1比糖基化的sCR1相对疏水性增高，热稳定性减低。但去糖基化的sCR1无论是其单体，还是聚合体，其亲水性都比糖基化的sCR1高。由此去糖基化的sCR1活性低于糖基化的sCR1，可能是由于形态学的改变或是二级结构的构象改变。大约5～6个去糖基化的sCR1单体聚合构成1个圆盘状的低聚体形式 ［11］ 。

    2   CR1的生物学活性

     在不同细胞上CR1的生物活性不尽相同，红细胞表面的CR1约占血循环中的85%以上具有广泛的生理作用。CR1作为免疫黏附（immune adherent，IA）受体而引起免疫黏附现象早已熟知。介导红细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞亚群、肾小球足突状细胞及囊状树突细胞与活化补体的免疫复合物结合，这种结合是一种共价形式的可逆结合［12］ 。所以此受体也称为C3b受体或C3b.C4b受体。据报道，红细胞上的CR1数约为50～1400个.细胞，其数目显著少于B细胞和吞噬细胞，但体内90%的CR1却存于红细胞上。CR1是C3b，iC3b（C3b的最初降解产物）与C4b的受体，它与C3b的亲和性最高。CR1 是内源性补体活性调节蛋白（RCA）家族成员，其活性最强，作用最广泛。CR1的配体为C3b.C4b及C3bi.C3c。其主要功能有:（1）抑制补体活性的作用:CR1仅为血清中H因子、C4结合蛋白浓度的1%时，即有相等的补体活化抑制作用，并不受补体旁路激活物的限制。CR1同时具有外源性及内源性活性，即既可灭活组装于非自身细胞膜上的C3.C5转化酶，也可灭活自身细胞膜上形成的C3.C5转化酶。CR1是唯一既对经典途径及替代途径C3.C5转化酶拥有衰变加速活性，又有辅助1因子裂解C3b和C4b作用的补体调节蛋白;（2）作为调理素受体，增强吞噬细胞对C3b.C4b包被颗粒及微生物的吞噬作用，以及对较小IC的内吞;（3）通过红细胞的CR1运送IC至肝脏等处经I因子裂解C3b，使IC与红细胞解离，再被单核细胞所清除;（4）为B细胞激活的调节剂。当CR1被含多个配体的IC交联时可激活B细胞，反之则产生抑制效应。并发现C1q-R与CR1在激活B细胞产生Ig的过程中有协同作用。有人认为CR1可通过将带有C3b或C3bi的抗原附着于B细胞表面而促进对抗原的识别。关于sCR1的来源，发现体外培养的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上清中有sCR1;将人的外周血白细胞移入严重免疫缺陷（SCID）小鼠体内后在其血清中也可检出sCR1，表明转移的白细胞可以合成sCR1。另外，通过以sCR1cDNA转染的COS细胞既可表达膜CR1，也可分泌sCR1，且与膜sCR1的分子量相同，说明sCR1由细胞分泌产生。血液中sCR1的水平与某此疾病具有一定的关联。发现sCR1水平升高与机体重要脏器的功能损害相平行，如晚期肾功衰竭和肝硬化的病人血液中sCR1的水平明显高于正常人，但经肾移植或肝移植后sCR1的水平可明显下降，甚至可降至正常水平。因此测定血中sCR1的水平对了解某些疾病的病情和判定治疗反应可能具有一定的意义。CR1的作用机制有如下阐述。CR1结合C3b、C4b，催化裂解补体活化中的C3和C5转化酶（经典途径是C4b2b，旁路途径是C3bBb）的活性亚单位C2bBb，并启动和加速I因子降解C3b、C4b，阻断补体活化的经典和旁路途径，减少补体活性片段的生成，包括膜攻击单位（C5b-9）、过敏毒素C5a等。CR1在协助I因子降解并释放自身结合的C3b、C4b后成为游离型，继续在血清中发挥生理作用，循环反复的抑制补体活化。

    3   sCR1基因的克隆和表达研究

     Weisman等研制出缺乏跨膜区和胞内区可溶性基因重组CR1胞外片段A。其原理是:在CR1的cDNA的6145位转入碱基序列TAA（转录终止密码），经中国仓鼠卵巢的细胞系（CHO）表达，产物为CR1的胞外片段和跨膜的第一个氨基酸（丙氨酸）。经证明，该片段保留了CR1的功能单位-C3b、C4b结合位点，可以结合并裂解C3b、C4b，并保留了CR1的1因子的辅助因子作用，达到抑制补体经典和旁路活化途径的目的。Gralinski等（1996年）［13］ 分别构建了缺乏LHR-A的sCR1［desLHR-A］。实验证明:sCR1［desLHR-A］在抑制体内经典途径激活上与sCR1有同等的能力。sCR1［desLHR-A］与CR1作为I因子降解液相C4b的辅助因子方面有同样的能力。Mulligan等（1997年）［14］ 设计了sCR1-sialy1Lewis（sCR1-唾液酸化的路易斯寡糖）和sCR1［desLHR-A］-sialy1Lewis，其目的是抑制炎症部位补体的激活和中性粒细胞的聚集。该抑制物的设计原理是以炎症过程中补体与选择凝集素间的相互作用及C5a可上调P-selectin为基础。选择素家族黏附分子的配体均为具有唾液酸化的路易斯寡糖sialy1，Lewis    x ，Sle      x ）或类似结构的分子。实验证明Slex能通过对E-selectin、P-selec-tin的结合抑制中性粒细胞黏附。ulligan等（1999年）［15］ 通过分子生物学技术将sialy1，Lewis x ，Sle x 分别与sCR1和sCR1［desLHR-A］一起表达，然后分别用于由蛇毒因子引起的补体激活后造成的E-selectin、P-selectin依赖性的小鼠肺损伤模型和免疫复合物沉积所致的L-selectin.P-selectin.E-electin依赖的肺损伤模型中，结果发现:在蛇毒因子模型中sCR1-Sle x ，sCR1［desLHR-A］-sialy1Lewis x 与sCR1、sCR1［desLHR-A］-ialy1Lewisx 相比，能显著减少肺内中性粒细胞的聚集和白蛋白的外渗;对肺血管的结合能力明显增加。在免疫复合物模型中，也获得了更为显著的结果。提示补体抑制剂经Slex修饰后，不仅可提高其抗炎效率，而且可增强对血管内皮细胞的定位能力。sCR1上述的基因克隆表达研究，均为真核细胞表达。虽其表达产物具有生物学活性，但因其产量不高造成生产成本过高，使sCR1制品无法产业化而导致临床应用研究受到限制。

    4   在创伤、缺血再灌注损伤中的应用价值及现状

     补体的激活有3条途径，研究发现创伤和缺血再灌注变性坏死的细胞、变性的蛋白聚集物、破坏后的细胞碎片、线粒体膜等经旁路途径激活补体［16］ 。补体系统激活产生C3a、C4a、C5a过敏毒素和C5b-9，特别是C5a一方面诱导肥大细胞脱颗粒，释放组织胺等炎症介质，收缩平滑肌细胞，增加血管通透性;另一方面C5a使中性粒细胞（PMNs）在缺血区浸润、聚集后的PMNs“呼吸爆发”而产生大量氧自由基，释放溶酶体酶、TNF-α、IL-6、NO等炎症介质，引起全身性炎症反应综合征（SIRS），进一步发展为多器官功能不全综合征（MODS）和机会感染。国内外学者针对补体介导缺血再灌注损伤的防治进行广泛的研究。用抗C5a抗体和C5a受体均能减轻实验动物缺血再灌注损伤。但是，补体介导的缺血再灌注损伤除了C5a之外，还有C5b-9等成分的共同作用。所以，针对某一种活化补体片段来防治缺血再灌注损伤的研究显然是局限的。但目前使用的多抗和单抗均为动物源性，如果将多种抗补体成分的抗体联合使用会出现拮抗作用和过敏反应。sCR1具有外源性及内源性活性，既可灭活组装于非自身细胞膜上的C3.C5转化酶，也可灭活自身细胞膜上形成的C3.C5转化酶。sCR1是唯一的既对经典、旁路、MBL3个补体激活途径C3.C5转化酶有抑制作用，又有辅助I因子裂解C3b和C4b作用的补体调节蛋白，能从始动部位抑制补体的过度活化。近年国外学者研制的sCR1在防治骨骼肌、肠道、肾脏等器官的实验动物缺血再灌注损伤模型上取得了较好的效果 ［17，18］ 。但由于sCR1制剂为中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞表达，表达产量不高而造成sCR1生产成本过高，使sCR1制剂的临床应用研究受到限制。如何实现高效表达且具有生物学活性的sCR1产品，能够应用于治疗创伤和缺血再灌 注引起的炎症损伤是一个亟待研究的课题。 

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